Экспериментальное исследование функциональной активности химерного антигенного рецептора NKG2D in vitro и in vivo

Abstract

Цель. Исследование противоопухолевого цитотоксического эффекта NKG2D CAR T-клеток и анти-CD19 CAR T-клеток in vitro и in vivo с целью сравнить противоопухолевую активность химерных антигенных рецепторов (CAR) разного структурно-функционального состава. Материалы и методы. Конструкции CAR были получены с помощью молекулярного клонирования; CAR T-клеточные популяции — путем трансдукции Т-лимфоцитов здорового донора рекомбинантными лентивирусными частицами, несущими последовательность CAR NKG2D или CAR к антигену-мишени CD19. Долю CAR T-клеток оценивали по флюоресценции белка FusionRed и по визуализации мембранного рецептора EGFR. Специфическую цитотоксическую активность эффекторных CAR T-клеток анализировали in vitro с помощью теста цитотоксичности в реальном времени (RTCA) при сокультивировании с клетками-мишенями линии HeLa_CD19, используя систему xCELLigence. Анализ синтеза интерферона-γ (IFN-γ) in vitro и in vivo и наличия цитотоксического эффекта проводили, используя иммуноферментный анализ культуральной среды сокультивированных клеток-эффекторов и мишеней, а также выделенной аутоплазмы периферической крови мышей. Для оценки функциональной активности клеток in vivo субпопуляции CAR-T (10 млн клеток/мышь) вводили иммунодефицитным мышам линии NSG-SGM3 спустя 12 дней после инъекции клеток линии HeLa_CD19 и подтверждения приживления и роста опухоли. Опухоли удаляли после эвтаназии и фиксировали в парафине для подготовки гистологических срезов. Анализ CAR T-клеточной инфильтрации опухолей осуществляли путем оценки иммуногистохимического окрашивания по антигену CD3. Результаты. Наивысшие уровни экспрессии лигандов (молекул MICA, ULBP1/2/3/4/5/6) обнаружены в клеточной линии HeLa. Полученные NKG2D CAR T-клетки характеризуются значительным цитотоксическим эффектом против линии-мишени HeLa_CD19 (клеточный индекс [КИ] = 1,27), но сниженным в 2 раза по сравнению с анти-CD19 CAR T-клетками (КИ = 0,60) (p = 0,0038). Уровень IFN-γ при сокультивировании анти-CD19 CAR T-клеток с HeLa_CD19 в соотношении Е/Т = 1:1 составил 64 852 пкг/мл, что в 3,5 раза больше уровня IFN-γ при сокультивировании NKG2D CAR T-клеток с HeLa_CD19 (18 635 пкг/мл) (p = 0,0360). Степень инфильтрации опухоли анти-CD19 CAR T-клетками была выше таковой у NKG2D CAR T-клеток. Отсутствие пролиферирующих NKG2D CAR T-клеток в периферической крови мышей подтверждает низкую их персистенцию. Концентрация IFN-γ в аутоплазме мышей из группы с введением анти-CD19 CAR T-клеток составила 11,89 пкг/мл, а в группе с введением NKG2D CAR T-клеток — 0,57 пкг/мл (p = 0,0079). Средняя масса опухолевых ксенографтов экспериментальных групп спустя 10 дней после введения анти-CD19 CAR T-клеток составила 0,72 г (p = 0,0142), Т-лимфоцитов и NKG2D CAR T-клеток — 2,12 и 1,2 г соответственно. Заключение. Анти-CD19 CAR T-клетки характеризуются более выраженным цитотоксическим эффектом как in vitro, так и in vivo экспериментальных условиях по сравнению с NKG2D CAR T-клетками. Степень пролиферации анти-CD19 CAR T-клеток и их инфильтрации в мышиных ксенографтных моделях в значительной степени выше уровней, полученных в случае инъекции NKG2D CAR T-клеток. Однократное введение NKG2D CAR T-клеток способствует лишь кратковременному уменьшению опухоли.

Keywords

• CAR T-клеточная терапия
• химерный антигенный рецептор NKG2D
• костимулирующие домены
• лиганды NKG2D
• цитотоксический эффект
• инфильтрация CAR T-клеток