应用 GFP质粒构建及转染技术探讨Syk(L)核移位机制

Abstract

【目的】 通过研究 Syk(L)在乳腺癌细胞亚细胞器中的分布和移位机制, 探讨 Syk(L)抑制乳腺癌的可能性机制。【方法】 采用细胞胞核、胞浆分离技术和 Western blot 的方法, 检测乳腺癌细胞系 BT474 中两种Syk 蛋白异构体在细胞内的分布。构建绿色荧光蛋白( GFP) 和 Syk(L)核移位相关功能域融合蛋白质粒, 转染入Cos 7 细胞内, 荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞内的分布。【结果】 BT474 细胞的细胞浆中可检测到 Syk(S)和 Syk(L)的表达, 细胞核中只检测到 Syk(L)的表达。在 Cos 7 细胞中, GFP 与 Syk(L)的缺失域( deletion domain, DEL 域) 融合蛋白均匀分布于细胞内, GFP 与 Syk(L)的 IDB 域融合蛋白聚集于细胞核中; 将DEL 域上的 294K、 300K、及 305K 突变域非碱性氨基酸后构建成 GFP- IDB(L)- M, 突变的融合蛋白则失去核聚集现象。【结论】 在乳腺癌细胞中, Syk(L)可从细胞胞浆移位到细胞核内。Syk(L)的 IDB 域具有完整的核移位功能, 能将融合的胞浆蛋白 GFP 转移到细胞核内; DEL 域的碱性氨基酸具有核定位信号功能。Syk(L)在乳腺癌细胞中的抑癌功能 与其核移位有关。