Anais da Academia Brasileira de Ciências (Jan 2013)
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Abstract
RNA replicon derived from Flavivirus genome is a valuable tool for studying viral replication independent of virion assembly and maturation, besides being a great potencial for heterologous gene expression. In this study we described the construction of subgenomic replicons of yellow fever virus by yeast-based homologous recombination technique. The plasmid containing the yellow fever 17D strain replicon (pBSC-repYFV-17D), previously characterized, was handled to heterologous expression of the green fluorescent protein (repYFV-17D-GFP) and firefly luciferase (repYFV-17D-Luc) reporter genes. Both replicons were constructed by homologous recombination between the linearized vector pBSC-repYFV-17D and the PCR product containing homologous 25 nucleotides ends incorporated into PCR primers. The genomic organization of these constructs is similar to repYFV-17D, but with insertion of the reporter gene between the remaining 63 N-terminal nucleotides of the capsid protein and 72 C-terminal nucleotides of the E protein. The replicons repYFV-17D-GFP and repYFV-17D-Luc showed efficient replication and expression of the reporter genes. The yeast-based homologous recombination technique used in this study proved to be applicable for manipulation of the yellow fever virus genome in order to construct subgenomic replicons.O replicon de RNA derivado do genoma de Flavivirus é uma ferramenta valiosa para o estudo de replicação viral independente da montagem e da maturação do virion, além de possuir um grande potencial para expressão de genes heterólogos. Neste estudo nós descrevemos a construção de replicons subgenômicos do vírus da febre amarela utilizando a técnica de recombinação homóloga em levedura. O plasmídeo contendo o replicon do vírus febre amarela cepa 17D (pBSC-repYFV-17D), caracterizado anteriormente, foi manipulado para a expressão heteróloga dos genes repórteres green fluorescent protein (repYFV-17D-GFP) e firelly luciferase (repYFV-17D-Luc). Ambos os replicons foram construídos por recombinação homóloga entre o vetor pBSC-repYFV-17D linearizado e o produto de PCR contendo 25 nucleotídeos terminais homólogos incorporados aos oligonucleotídeos iniciadores. A organização genômica dos construídos é semelhante ao repYFV-17D, com inserção de um gene repórter entre os restantes 63 nucleotídeos N-terminais da proteína do capsídeo e 72 nucleotídeos C-terminais da proteína E. Os replicons repYFV-17D-GFP e repYFV-17D-Luc mostraram uma eficiente replicação e expressão dos genes repórteres. A técnica de recombinação homóloga em levedura usada neste estudo demonstrou ser aplicável à manipulação do genoma do vírus da febre amarela para a construção de replicons subgenômicos.
