Medicina (Jun 2005)
Evaluación de la Actividad Resortiva de Macrófagos de Línea Celular Humana y de Ratón Fusionados con PEG
Abstract
Premio Aventis – Ciencias Básicas y Experimentales. LIBROS DE MEDICINA. Los osteoclastos son células grandes multinucleadas, tienen diferentes características que incluyen la expresión de la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP), receptor de calcitonina (RCT) y la capacidad de resorber hueso. Su origen no se ha dilucidado plenamente, sin embargo hay evidencias que sugieren que los osteoclastos proceden de la fusión de precursores mononucleares pertenecientes al linaje monocito/macrófago. En este trabajo quisimos evaluar si es la fusión per se la que promueve la actividad de los osteoclastos o si se requiere activación previa de los precursores de osteoclastos con hormonas osteoclastogénicas. Para responder esta pregunta fusionamos artificialmente macrófagos de la línea celular U937/A (humanos) o J774 (ratón) con polietilenglicol (PEG) en un estado no confluente del cultivo. Se evaluó la capacidad de formación de “TRAP positive multinuclear cell” (TPMNC) y su capacidad resortiva sobre láminas de hueso bovino tanto en macrófagos sin estimular como pre estimulados con hormona paratiroidea (PTH), 1a,25-(OH)2D3, dexametasona, RANKL o BMP2. Los resultados mostraron que al fusionar macrófagos con PEG de ambas líneas se aumentó el número de células TRAP positivas al igual que su capacidad resortiva. Además la confluencia del 100% y la sincronización de las células en metafase y Go aumentan la formación de TPMNC. Respecto a las hormonas, la PTH (0.01µM) aumentó la capacidad resortiva de las TPMNC, mientras que la 1a,25- (OH)2D3, dexametasona, RANKL y BMP2 disminuyeron dicha capacidad. Concluimos que la fusión de macrófagos de las líneas celulares U937/A o J774 con PEG induce la formación de células multinucleadas con actividad resortiva y en todos los experimentos se demostró que es la fusión per se, más no los estímulos con hormonas osteoclastogénicas, excepto PTH, el evento que lleva a la formación de células con actividad resortiva. (El artículo completo está siendo sometido para publicación por la revista «Bone» y consta de 15 figuras no presentadas aquí). Palabras claves: Fusión de macrófagos, osteoclasto, polietilenglicol, TRAP, resorción ósea. INTRODUCCIÓN El hueso tiene un recambio constante como resultado de la actividad de los osteoblastos y los osteoclastos, en el cual los osteoclastos degradan la matriz orgánica e inorgánica del hueso y el proceso es revertido por los osteoblastos en un proceso fisiológico llamado remodelamiento óseo (1).Se ha demostrado que algunos factores como el RANKL y MCS-F secretados por las células estromales/osteoblastos estimulan la osteoclastogénesis (1). Estas dos citoquinas son requeridas para inducir la expresióntanto de genes que tipifican el linaje osteoclasto como de los genes que codifican para la fosfatasa ácida resistente al tartrato (fosfatasa ácida resistente al tartrato) (TRAP), catepsina K (CATK), receptor de calcitonina (CT) y la integrina ß3 lo que lleva al desarrollo de osteoclastos maduros (1, 2).Una vez las células precursoras de los osteoclastos han proliferado se lleva a cabo la fusión de dichas células (3). La fusión celular es un evento en el cual las membranas de las células a fusionarse se acercan, entran en contacto y tras mezclar los lípidos de sus bicapas forman un poro de fusión el cual se expande y permite el contacto de los citoplasmas (4, 5). Una hipótesis sugiere que los macrófagos en respuesta a estímulos locales, expresan una maquinaria de fusión proteica, la cual es inducida inicialmente y reprimida cuando se completa la fusión/multinucleación. Se han descrito tres proteínas involucradas en la fusión de macrófagos: el receptor de fusión de macrófagos (MFR) (7), CD47 y CD44 (9). Se han identificado varias moléculas que intervienen en la diferenciación y activación de los osteoclastos (10) como M-CFS (macrophague colony-stimulating factor), RANKL (receptor activator nuclear factor kappa B ligand), bone morphogenetic proteins (BMPs) las cuales son miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformante (TGF-ß); su efecto es aumentar la diferenciación de los osteoclastos. Dentro de las BMPs se encuentra la BMP2 la cual aumenta la formación de los osteoclastos a partir de macrófagos derivados de médula ósea (11). Igualmente, la PTH (2, 12, 13) y la 1a,25-(OH)2D3 (14) tienen efectos sobre el hueso tanto en la formación como en la degradación de éste ya que ambas hormonas estimulan la expresión de genes involucrados en la formación ósea en los osteoblastos así como también la expresión de RANKL, citoquina que promueve la formación de osteoclastos. Por su carácter de células multinucleadas, los osteoclastos no se reproducen; esto hace que experimentalmente sea difícil tener un cultivo primario de estas células o una línea celular. Con los modelos reportados en la literatura para obtención de osteoclastos (2, 6, 11, 12, 15, 16, 17, 18) no se puede separar el efecto que pueda tener la confluencia celular o elrepetidas con el procedimiento GLM de SAS. El nivel de significancia usado fue de 95% (alpha =0.05)...
