Identificación de las proteínas secretadas por el hongo Ustilago maydis (DeCandole) Corda (Basidiomiceto) cultivado en condiciones in vitro

Abstract

Introducción: Ustilago maydis es un hongo basidiomiceto que infecta al maíz y teozintle produciendo una enfermedad conocida como carbón común o huitlacoche. Actualmente no existen reportes acerca del secretoma del hongo cultivado bajo condiciones in vitro. Un estudio de esta naturaleza permitiría caracterizar los genes involucrados en varios procesos importantes, entre los que se tienen aquellos relacionados con la nutrición, la patogenicidad y la diferenciación del hongo. El objetivo de esta investigación fue identificar las proteínas secretadas al medio de cultivo por las formas de levadura o micelio de este hongo cultivado en dos condiciones de pH. Método: Se generaron las formas de micelio o levadura de Ustilago maydis (cepa FB2¿a2b2) a través del cultivo en medios mínimos con pH 3 y 7 respectivamente y se determinó su cinética de crecimiento. Las proteínas secretadas al medio se concentraron en una columna de fase reversa Sep-Pak Plus C18 y se eluyeron con una solución de acetonitrilo (60 %) + ácido trifluoroacético (0.1 %), seguida de su liofilización parcial, y precipitación con ácido tricloroacético-acetona. Posteriormente las muestras fueron sometidas a electroforesis en poliacrilamida (SDS-PAGE) y los geles teñidos con azul de Coomassie. Las bandas de proteína se cortaron del gel y se digirieron con tripsina. Las mezclas de péptidos fueron inyectados para su análisis en un espectrómetro de masas y el espectro MS/MS obtenido fue procesado en Masslynx 4.0 antes de someterlo al programa MASCOT (Matrix Science) para realizar las búsquedas no-redundantes en la base de datos del National Center for Biotechnology Information. Resultados: El crecimiento de U. maydis a pH 7 fue mayor que a pH 3 (D.O. a 600 nm= 1.35 y 0.85, respectivamente) a las 30 h de incubación. El proceso dimórfico de levadura a micelio a pH 3 se inició a las 8 h después de iniciados los cultivos. A las 30 h de cultivo se observó que el 100 % de las células tenían una morfología micelial. A este tiempo, se colectó el sobrenadante y se sometió al proceso descrito anteriormente, obteniéndose de manera reproducible 8 bandas de proteína del medio mínimo del cultivo a pH 7 y 2 del medio mínimo del cultivo de pH 3. Las proteínas se analizaron, pero solo fue posible identificar 5, todas ellas provenientes del medio de pH 7, cuyas masas teóricas oscilan entre 31 y 68 kDa y presentan valores de punto isoeléctrico calculados en un rango de 4.72 a 10.13. Cuatro de las 5 proteínas fueron identificadas como de secreción de U. maydis. Tres de las 5 proteínas son de función desconocida, una está relacionada con el precursor de la spherulin 4 y la última parece ser una proteína GPI (glycosyl phophotidylinositol ) relacionada con una glucanasa. Discusión o Conclusión: Los resultados aquí presentados son los primeros datos descritos de proteínas secretadas al medio en condiciones in vitro por la forma de levadura de U. maydis Con este trabajo se establecieron las bases para el estudio posterior del secretoma del hongo.