Expression of Novel Bifunctional Glutathione Synthetase in Pichia pastoris and Escherichia coli(新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达)

Abstract

通过裂解无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank 上已发表的无乳链球菌（菌种编号ATCC13813）新型双功能谷胱甘肽合成酶基因（gshF）的核酸序列与2 种不同表达载体多克隆位点序列，分别设计引物F1、R1 和F2、R2，再以总DNA 为模板，经过特异性PCR 扩增出长度约为2 200 bp 的目的基因。随后分别对目的基因gshF 和2 种表达载体进行双酶切、连接等操作，得到表达载体pPIC9K-gshF 与 pET-gshF。用Sal I 线性化表达载体pPIC9K-gshF 后电转至毕赤酵母GS115 中。经MD 平板筛选重组子、菌落 PCR 鉴定阳性菌株、G418 抗性梯度平板筛选多拷贝菌株，最终在4.0 mg·mL-1 G418 抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2% 的BMMY 培养基诱导该阳性菌株表达，每隔12 h 取样并添加甲醇，96 h 后离心收集发酵上清，经SDS-PAGE 蛋白电泳显示：在85 kDa 处出现1 条明显蛋白带，大小与预期GshF 蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF 用IPTG 诱导表达，先在37 ℃下培养90 min，再加入IPTG 至1 mmol·L-1 后诱导7 h，离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后，进行SDS-PAGE 蛋白电泳，同样在85 kDa 处有1 条蛋白带。采用Bradford 法测定2 种表达产物上清的蛋白量，其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL-1，重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL-1。测定并比较2 种不同表达方式所得酶活，发现GshF 在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL-1，经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL-1。

Keywords

• 新型双功能谷胱甘肽合成酶
• 发酵表达
• 谷胱甘肽