基因步移在分离蚊虫细胞色素P450启动子中的应用及意义

Abstract

【目的】快速扩增出白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP 6N3 基因(CYP 6N3)上游启动子区序列。【方法】根据本 室已获得的白纹伊蚊CYP 6N 亚家族新成员CYP6 N3 全长cDNA 的5′-末端核苷酸序列, 设计2 个反向特异引物(GSP1 和 GSP2), 利用4 种限制性内切酶Dra Ⅰ 、EcoRⅤ 、Pv u Ⅱ 和Stu Ⅰ 分别消化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株高分子量基因组DNA , 消化产物与适配子连接产生4 种消化的DNA 库(DL1、DL2、DL3 及DL4), 并分别以此为模板, 进行基因步移。用特异引物 GSP1 与适配子引物AP1 进行第1 步PCR 扩增, 然后再以第1 步PCR 产物为模板、用内部特异引物GSP2 与内部适配子引物 AP2 进行第2 次PCR 扩增。【结果】第1 步PCR 结果显示:在上述4 种消化文库中分别扩增出约806 、2 190 、2 206 和3 076 bp 的特异条带;第2 步PCR 结果与第1 次PCR 相类似, 但各泳道主带扩增效率明显升高。【结论】本实验已成功地获得了白纹 伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP 6N3 上游启动子区核苷酸序列及其4 种限制性内切酶图谱。此外还对基因步移法在昆虫细胞色 素P450 多样性及其参与杀虫剂抗性分子机理研究中的意义进行了讨论。