ANÁLISIS PROTEÓMICO DE CULTIVOS PRIMARIOS DE TIROIDES

Abstract

En el presente estudio se identificaron proteínas de expresión constitutiva, como vimentina, actina, tubulina, proteína de choque térmico de 60 kDa, peroxirredoxina y la ATP sintasa mitocondrial, en cultivos primarios de tiroides normales y de carcinoma papilar de tiroides. Se establecieron las condiciones de extracción, solubilización, análisis cuantitativo y cualitativo de dichas proteínas, y se buscaron las mejores condiciones de isoelectroenfoque (IEF) en la electroforesis en dos dimensiones (2D). En la extracción y solubilización de las proteínas se evaluó la presencia o ausencia de anfolitos y sales, se obtuvo un mejor resultado empleando en el amortiguador de extracción sales como Tris-HCl y acetato de magnesio que incrementan la solubilidad de las proteínas. Para la cuantificación se recomienda el uso conjunto de técnicas colorimétricas con la electroforesis SDS-PAGE tiñendo con azul de Coomassie y corroborando los resultados mediante western blot, lo cual permite, además, verificar la integridad de las proteínas. Respecto a la electroforesis en dos dimensiones, se obtuvieron geles con un mayor número de manchas (spots), resueltos, enfocados y reproducibles empleando en el IEF gradientes inmovilizados de pH de 4-7 y voltaje final de 8.000 V. Las proteínas se identificaron mediante el análisis bioinformático de los geles 2D con el programa PDQuest (PDQuest 7.2, Bio-Rad®) y MALDI-TOF.