CÉLULAS TUMORAIS CIRCULANTES POR CITOMETRIA DE FLUXO DE NOVA GERAÇÃO EM TUMORES SÓLIDOS PEDIÁTRICOS – BIÓPSIA LÍQUIDA PARA DIAGNÓSTICO E SEGUIMENTO

Abstract

Objetivos: Células tumorais circulantes (CTCs) são células raras no sangue periférico de pacientes com câncer, refletindo o estado tumoral em tempo real. A detecção de CTCs pode indicar disseminação metastática e formação de micrometástases. Tumores sólidos pediátricos representam cerca de 30% das malignidades pediátricas, com subtipos como neuroblastoma, rabdomiossarcoma, sarcomas ósseos e tumor de Wilms. O diagnóstico padrão-ouro não aborda a heterogeneidade tumoral e suas metástases. A citometria de fluxo de próxima geração (NGF- Next Generation Flow) é uma abordagem promissora para identificar CTCs em tumores sólidos pediátricos. Este trabalho visa detectar CTCs por NGF em pacientes com suspeita de tumores sólidos pediátricos ao diagnóstico e durante o seguimento. Material e métodos: Alíquotas de 2-4ml de sangue periférico, coletadas em centros pediátricos no Brasil e Europa, foram tratadas com cloreto de amônio para lise de hemácias. As amostras foram marcadas com anticorpos monoclonais para tumores sólidos (STOT): cyCD3+CD271/CD45/CD8+CD99/nuMiogenina/CD4+EpCAM/CD56/GD2/smCD3+CD19+FVS780. Foram adquiridos 5 milhões de eventos no citômetro FACSCantoII® e analisados no Infinicyt®. Resultados: Foram analisadas 128 amostras de sangue periférico de 125 pacientes (3 pacientes ao diagnóstico e no seguimento), com mediana de idade de 6 anos (0-17 anos), suspeitos de câncer pediátrico, usando um tubo de 12 marcadores/8 cores, STOT- “Solid Tumor Orientation Tube” para detecção de CTCs. Das amostras, 12/128 (9%) apresentavam CTCs (neuroblastomas - 8/31 (25%); rabdomiossarcomas – 3/11 (27%); e meduloblastoma - 1/3 (33%)). Todos os pacientes com CTCs ao diagnóstico apresentavam doença disseminada. De acordo com os marcadores utilizados, as CTCs de tumores sólidos não-hematopoiéticos apresentaram o seguinte fenótipo: i) neuroblastoma: CD45-/ CD56++/ GD2++/ CD271-/ nuMiogenina-/ EpCAM-; ii) rabdomiossarcoma: CD45-/ CD56++/ GD2-/ CD271++/ nuMiogenina-/+fraco/ EpCAM-; meduloblastoma: CD45-/ CD56++/ GD2+/CD271-/nuMiogenina-/EpCAM-). A mediana de eventos adquiridos foi de 3,4 × 10-6 (9,7 × 104 - 3,1 × 106), com limite de detecção mediano de 1,5 × 10-5 (4,6 × 10-6 – 3,4 × 10-5). Discussão: A combinação de marcadores no STOT, via NGF, identificou corretamente as CTCs dos principais tumores sólidos pediátricos não-hematopoiéticos com um limite de detecção de até 10-6, sendo superior aos métodos moleculares descritos na literatura. Todos os pacientes apresentavam disseminação de doença ao diagnóstico correlacionando diretamente a presença de CTCs com seu estadio avançado. Em cada subgrupo tumoral analisado, o NGF foi capaz de detectar as CTCs em cerca de 30% dos pacientes estudados. Deste modo, a metodologia do NGF permite, a partir de uma amostra de SP, exame menos invasivo que as biópsias tradicionais, identificar precocemente as CTCs, sendo de grande impacto no diagnóstico, estadiamento e avaliação da resposta ao tratamento. Conclusão: A técnica de citometria de fluxo foi capaz de identificar CTCs em mais de 1/3 dos casos no SP de pacientes com tumores sólidos pediátricos. A diferente frequência de infiltração nos subtipos de tumores sólidos pediátricos pode estar relacionada ao potencial metastático dos subtipos tumorais ou devido a alguma limitação técnica do método. Nas seguintes etapas do trabalho, pretende-se ampliar a casuística e comparar com métodos moleculares a partir da biópsia líquida.