DEVELOPMENT AND STANDARDIZATION OF AN INDIRECT ELISA FOR THE DIAGNOSIS MAEDI-VISNA IN SHEEP DESENVOLVIMENTO E PADRONIZAÇÃO DE UM ELISA INDIRETO PARA DIAGNÓSTICO DE MAEDI VISNA EM OVINOS

Abstract

<span style="font-size: 10pt; color: black; font-family: 'Times New Roman','serif'">The objective of this work was to develop and standardize an indirect ELISA for diagnosis of Maedi Visna (MV) infection. </span><span style="font-size: 10pt; color: black; font-family: 'Times New Roman','serif'">The antigen was produced from the supernatants of caprine synovial membrane (CSM) cell monolayers inoculated with Maedi Visna virus (MVV), strain K1514, by cycles of freezing and thawed, and clarified by centrifugation at 3000 g for 40 min. The clarified suspension was precipitated with PEG 8000 and centrifugated at 12000 g for 60 min; the pellet was resuspended in buffer TNE and layered onto a sucrose cushion by centrifugation at 42000 g for 105 min. The pellet was resuspended in PBS containing phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF). The ELISA was performed in 96 wells plates, incubated for 1 h at 37 ºC. The reaction was detected by incubation with the enzyme substrate and o-phenylenediamine (OPD) during 15 min.<span> </span>The tests were compared using 175 sera samples. The concentration of the antigen was 2 µg/mL and the best dilution of the sera was 1:100. ELISA detected more positive samples (22.9%) than AGID (6.3%) and presented a better sensitivity than AGID and, although the specificity was below the expected, it could already be recomended in the diagnosis of MVV infection.</span><span style="font-size: 10pt; color: black; line-height: 115%; font-family: 'Times New Roman','serif'">KEY WORDS: ELISA, MaediVisna, serologic diagnosis, sheep lentivirus.</span> <span style="font-size: 10pt; color: black; font-family: 'Times New Roman','serif'">O objetivo deste trabalho foi desenvolver e padronizar um ELISA indireto para diagnóstico de Maedi Visna (MV). Produziu-se o antígeno em sobrenadantes de cultivo celular de membrana sinovial caprina (MSC) inoculado com o Maedi Visna Vírus (MVV) cepa K1514, que passou por ciclos de congelamento e descongelamento, sendo logo após clarificado por centrifugação a 3.000 g por 40 minutos A suspensão clarificada foi precipitada por PEG 8000, centrifugada a 12.000 g por 60 minutos, o </span><span style="font-size: 10pt; color: black; font-family: 'Times New Roman','serif'">pellet</span><span style="font-size: 10pt; color: black; font-family: 'Times New Roman','serif'"> ressuspendido em TNE (Tampão Tris-HCl, NaCl, EDTA) e ultracentrifugado a 42.000 g por 105 minutos em colchão de sacarose, e ressuspendido em PBS contendo </span><span style="font-size: 10pt; color: black; font-family: 'Times New Roman','serif'">phenylmethylsulphonyl fluoride</span><span style="font-size: 10pt; color: black; font-family: 'Times New Roman','serif'"> (PMSF). Realizou-se o ELISA em microplacas de 96 poços, incubadas por 1h a 37 ºC, utilizando-se como revelador o-phenylenediamine (OPD). Para a comparação entre os testes de ELISA e AGID, utilizaram-se 175 amostras de soros. A concentração ótima do antígeno foi a de 2 µg/mL e a melhor diluição dos soros, controles e testes de 1:100. O ELISA detectou um maior número de positivos (40) que o AGID (11), apresentando uma sensibilidade de 91%, especificidade de 82%. O ELISA promoveu uma melhor sensibilidade que o AGID. Embora sua especificidade tenha ficado abaixo do esperado, seu uso pode ser indicado como teste de diagnóstico de MVV.</span><span style="font-size: 10pt; color: black; line-height: 120%; font-family: 'Times New Roman','serif'">PALAVRAS-CHAVES: Diagnóstico sorológico, ELISA, lentivírus ovino, MaediVisna.</span>

Keywords

• Medicina Veterinária Preventiva