ANÁLISE DA DOENÇA RESIDUAL MÍNIMA POR SEQUENCIAMENTO GÊNICO EM LEUCEMIA LINFOIDE AGUDA PEDIÁTRICA TRATADA CONFORME PROTOCOLO AIEOP-BFM ALL 2009 COM CRITÉRIOS DE RISCO MODIFICADOS

Abstract

Objetivo: Avaliar impacto da análise prospectiva da Doença Residual Mínima (DRM) por sequenciamento gênico (Next Generation Sequencing, NGS), no Dia 33 (D33) e Semana 12 (S12) do tratamento, na Sobrevida Livre de Eventos (SLE) da Leucemia Linfoide Aguda (LLA) pediátrica. Material e métodos: De outubro de 2021 a abril de 2023, 146 pacientes consecutivos com LLA de novo, negativa para t(9;22)BCR-ABL1, e idade de 1 a 18 anos, foram tratados de acordo com o protocolo AIEOP BFM ALL 2009 com critérios de risco modificados descritos a seguir. Definição do grupo de Alto Risco (AR): ausência de remissão completa no dia 33 ou KMT2A-AFF1+ ou TCF3-HLF+ ou hipodiploidia ou DRM por Citometria de Fluxo em medula óssea do dia 15 ≥ 10% e não ETV6-RUNX1 ou IKZF1plus e DRM (NGS) em D33 positivo (ou inconclusivo) desde que não seja ETV6-RUNX1+, TCF3-PBX1+ ou KMT2A rearranjado ou DRM em D33 ≥ 5 × 10-4 e S12 positivo, porém < 5 × 10-4 ou DRM em S12 ≥ 5×10-4. Grupo de Baixo Risco (BR) definido como: sem critérios de alto risco e DRM em D33 negativo para todos os marcadores investigados (ao menos um marcador com sensibilidade ≤ 10-4) ou DRM (NGS) em D33 inconclusivo desde que DRM negativa em S12 e D15 (por citometria de fluxo) < 0,1%. Risco Médio (MR): ausência de critérios de AR e sem critérios de BR. Para análise da DRM foram utilizados primers Biomed2 para amplificação dos rearranjos IGH, IGK, IGL, TCRG e TCRD, acrescidos de adaptadores para sequenciamento na plataforma Illumina. Foram utilizados 600 ng de DNA genômico, acrescido de diferentes quantidades de DNA de plasmídeos contendo rearranjos Ig/TCR, para normalização dos resultados. Foram lidos no mínimo 500.000 ‘reads’ por rearranjo, sendo dois os rearranjos analisados por paciente, se disponíveis. Os dados foram analisados na plataforma VidJil. Resultados: Remissão citológica foi atingida em 96% (142/146) dos pacientes. Morte durante o período de indução ocorreu em 2 pacientes (1,3%). Análise da DRM por NGS no D33 foi realizada em 137 pacientes (93%), sendo negativo em 80 pacientes (54%) e positivo em 57 (39%) pacientes. A Sobrevida Global e SLE em 1,3 anos dos 146 pacientes foi de 94,2±2,5% e 92,2 ± 2,0%, respectivamente. Pacientes com DRM ≥ 5×10-4 no D33 apresentaram SLE significativamente inferior a pacientes com DRM negativa ou abaixo dessa linha de corte (84,8 ± 5,9% vs. 98,2 ± 1.8%, p < 0,001). Na S12 a diferença entre os grupos foi ainda mais acentuada (SLE: 49,2 ± 1,7% vs. 97,7±1,7%, p < 0,001). Discussão: A avaliação da DRM por NGS permite rastrear vários subclones Ig/TCR no mesmo ensaio, prescinde do desenho e seleção de primers paciente-específicos. O custo dos reagentes e plásticos para o NGS é comparável ao qPCR, porém o NGS é mais rápido e demanda menos mão de obra. Dados da literatura mostram que os valores de DRM mensurados por NGS tem alta correlação com dados obtidos por qPCR. O qPCR, entretanto, parece dar mais falsos positivos do que o NGS, especialmente em se tratando de valores muito baixos de DRM (< 5×10-5). Conclusão: Nossos resultados, embora interinos, mostram que a avaliação prospectiva da DRM pelo sequenciamento gênico é factível e permite identificar grupos de pacientes com SLE significativamente diferente.