ATM失活诱导GADD45α依赖的小脑颗粒神经元凋亡

Abstract

目的探究共济失调毛细血管扩张突变（ATM）激酶失活诱导神经元凋亡的具体分子机制。方法体外成熟7 d的小脑颗粒神经元（CGNs）分别用含25 mmol/L KCl（25 K）培养基、5 mmol/L KCl（5 K）培养基和含ATM特异性抑制剂（Ku55933，10 µmol/L；Ku60019，15 µmol/L）的25 K培养基后进行免疫印迹检测ATM、Caspase3、Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平或培养8 h后进行Hoechst染色分析。在C6细胞和CGNs中转染ATM和GADD45α特异性siRNA，q-PCR和免疫印迹验证其干扰效率。体外成熟5 d的CGNs通过磷酸钙转染ATM特异性siRNA和pCMV-EGFP 48 h后进行Hoechst染色和凋亡分析。体外成熟7 d的CGNs用含ATM特异性抑制剂的25 K培养基培养8 h后进行全转录组测序、差异表达基因鉴定和通路富集分析。体外成熟5 d的CGNs通过磷酸钙转染GADD45α特异性siRNA和pCMV-EGFP 48 h，用含15 µmol/L Ku6的25 K培养基处理8 h或5 K培养基处理 8 h后进行Hoechst染色和凋亡分析。结果与25 K组相比，5 K处理组和ATM特异性抑制剂处理组的CGNs ATM蛋白表达降低、Cleaved Caspase-3蛋白表达增加、细胞核固缩率增加。C6细胞和CGNs中转染ATM和GADD45α特异性siRNA后有效降低ATM 和GADD45α 的mRNA和蛋白的表达。与对照相比，CGNs转染ATM特异性siRNA 后，细胞核固缩率升高。在Ku55933处理组中鉴定出835个基因表达上调，848个基因表达下调；在Ku60019处理组中鉴定出454个基因表达上调，314个基因表达下调；274个基因在Ku5处理组和Ku6处理组中共同上调，179个基因在Ku5处理组和Ku6处理组中共同下调，其中ATM下游靶标GADD45α表达上调；通路富集结果显示TNF信号通路、NF-κB信号通路和凋亡信号通路等被显著富集。与对照相比，抑制剂处理组和5K组GADD45α的mRNA和蛋白表达均升高。与对照相比，转染GADD45α特异性siRNA后用含15 µmol/L Ku60019的25 K培养基处理8 h或5 K培养基处理后的CGNs细胞核固缩率降低。结论ATM活性降低诱导GADD45α依赖的神经元凋亡。

Keywords

• 神经元凋亡;共济失调毛细血管扩张突发;生长停滞和DNA损伤诱导蛋白45α;转录组测序