Efecto Del IFN-γ en la inducción de Trampas Extracelulares de los Neutrófilos (NETs) en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica

Abstract

INTRODUCCIÓN: las células fagocíticas emplean varios mecanismos moleculares para promover la destrucción de microorganismos en el hospedero. Recientemente se describió un nuevo mecanismo microbicida denominado Trampas Extracelulares de los Neutrófilos (NETs por sus siglas en inglés), el cual se propone que funciona induciendo activamente la liberación de redes de cromatina y proteínas granulares hacia el medio extracelular, promoviendo la captura y posterior destrucción de microorganismos patógenos. Este mecanismo ha sido descrito como un proceso de muerte celular diferente a la necrosis o apoptosis. Las NETs se forman a través de un mecanismo dependiente de la generación de especies reactivas del oxígeno por parte del sistema NADPH oxidasa de los neutrófilos (PMNs). La Enfermedad Granulomatosa Crónica (EGC, OMIM #306400) es una inmunodeficiencia primaria caracterizada por una falla en la producción de ROS debida a mutaciones en genes asociados a este sistema y recientemente se demostró que en estos pacientes no hay liberación de NETs, lo cual sugiere que esto podría contribuir a la susceptibilidad a infecciones severas por ciertos patógenos. El uso del IFN-y recombinante (rIFNg) en pacientes con EGC es una terapia estándar que contribuye a la acción microbicida del PMN y reduce la susceptibilidad a las infecciones en estos pacientes, sin embargo no es claro el o los mecanismos moleculares mediante los cuales el IFN-y actúa en los PMN. Se pretende determinar si el IFN-y tiene algún efecto sobre la producción de NETs en neutrófilos de individuos sanos y de pacientes con EGC y si la producción de estas estructuras se puede modular con diferentes estímulos sintéticos y microbianos. En el presente reporte describimos los avances en la estandarización de la producción de NETs en PMN de individuos sanos y el efecto del IFNg en la producción de estos. MATERIALES Y MÉTODOS: se tomaron 5 ml de sangre periférica por punción venosa en tubo con EDTA de controles sanos. De la muestra fueron separados los PMNs por gradiente de densidad (Polymorphprep TM Application sheet). 2x105 PMNs cultivados en RPMI a 37º C en 5% de Co2 (Invitrogen) y pre-estimulados con IFN-γ 100UI/ml fueron activados con PMA 25nM para la determinación de ROS y NETs. La cuantificación de ROS se hizo a través de citometría de flujo con dihidrorodamina (DHR). La observación de las NETs se hizo mediante ensayo cualitativo a través de microscopia de fluorescencia convencional y la cuantificación mediante fluorometría en un espectrofluorómetro (Spectra Max Gemini – Molecular devices). En ambos casos se utiliza Sytox Green para la tinción del DNA. Como controles se utilizaron DPI 10 uM y DNAsa 100 UI/ml. RESULTADOS: el estímulo con IFN- γ no produjo por sí mismo un aumento en la producción de ROS, mientras que al hacer una pre-estimulo con IFN- γ y posterior activación con PMA 25nM hay un incremento en el índice de estimulación de los PMNs con respecto a los que solo tienen el estímulo con PMA 25 nM. Los neutrófilos activados con PMA 25 nM producen NETs a partir de 1 hora de estímulo. Al hacer un pre-estimulo de los PMNs con IFN- γ 100 hay un aumento en la producción de NETs. CONCLUSIÓN: estos resultados preliminares indican que el IFN- γ potencia tanto la producción de ROS como la producción de NETs en individuos sanos lo cual es promisorio a la hora de evaluar su efecto en los pacientes con EGC.