Cellular changes in motor neuron cell culture produced by cytotoxic cerebrospinal fluid from patients with amyotrophic lateral sclerosis

Abstract

Introduction: The neurotoxic effects of cerebrospinal fluid (CSF) from patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) have been reported by various authors who have attributed this neurotoxicity to the glutamate in CSF-ALS. Materials and methods: Cultures of rat embryonic cortical neurons were exposed to CSF from ALS patients during an incubation period of 24 hours. Optical microscopy was used to compare cellular changes to those elicited by exposure to 100 μm glutamate, and confocal microscopy was used to evaluate immunohistochemistry for caspase-3, TNFα, and peripherin. Results: In the culture exposed to CSF-ALS, we observed cells with nuclear fragmentation and scarce or null structural modifications to the cytoplasmic organelles or to plasma membrane maintenance. This did not occur in the culture exposed to glutamate. The culture exposed to CSF-ALS also demonstrated increases in caspase-3, TNFα, and in peripherin co-locating with caspase-3, but not with TNFα, suggesting that TNFα may play an early role in the process of apoptosis. Conclusions: CFS-ALS cytotoxicity is not related to glutamate. It initially affects the nucleus without altering the cytoplasmic membrane. It causes cytoplasmic apoptosis that involves an increase in caspase-3 co-located with peripherin, which is also overexpressed. Resumen: Introducción: Los efectos neurotóxicos del líquido cefalorraquídeo (LCR) procedentes de pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (ELA) han sido descritos por varios autores que han atribuido esta neurotoxicidad al efecto de glutamato del LCR-ELA. Material y métodos: Se han expuesto cultivos de neuronas embrionarias corticales de rata con un incubación de 24 h y el LCR procedente de pacientes con ELA, valorando las alteraciones celulares a través de microscopía óptica en comparación con aquellas que produce con 100 mM de glutamato y la inmunohistoquímica de caspasa-3, TNF y periferina a través de microscopia confocal. Resultados: En el cultivo expuesto a LCR-ELA se observan células con fragmentación del núcleo con escasa o nula modificación estructural de los organelos citoplasmáticos y mantenimiento de la membrana plasmática, lo que no ocurre con la exposición a glutamato. Se observa un aumento de caspasa-3 y de TNFα y un incremento de periferina que co-localiza con caspasa-3 pero no con TNFα, lo hace sugerir que puede tener un papel precoz en el desarrollo de la apoptosis. Conclusiones: La citotoxicidad por LCR-ELA no se relaciona con el glutamato, que provoca una afectación nuclear precoz sin alteración de la membrana citoplasmática produciendo una apoptosis citoplasmática que conlleva un incremento de caspasa-3 que co-localiza con sobreexpresión anómala de periferina. Keywords: Amyotrophic lateral sclerosis, Cerebrospinal fluid, Neurotoxicity, Peripherin, Caspase-3, TNFα, Glutamate, Palabras clave: Esclerosis lateral amiotrófica, Líquido cefalorraquídeo, Neurotoxicidad, Periferina, Caspasa-3, TNFα, Glutamato