A IMPORTÂNCIA DO PCR DIGITAL NA DETECÇÃO DA MUTAÇÃO D816V DO GENE KIT NO DIAGNÓSTICO DA MASTOCITOSE SISTÊMICA

Abstract

Objetivo: Recentemente, a reação em cadeia da polimerase digital (dPCR) surgiu como um método sensível, rápido e de custo efetivo para detectar diferentes marcadores tumorais de baixa frequência alélica. Este estudo teve como objetivo padronizar e validar um teste para detecção da mutação D816V do gene KIT em pacientes com suspeita de mastocitose sistêmica (MS) por dPCR na rotina laboratorial. Materiais e métodos: Foram utilizadas amostras de DNA genômico extraídas do sangue periférico de 17 pacientes com suspeita de MS com o kit QIAamp® DNA Blood Midi Kit. A pesquisa da mutação D816V do gene KIT foi realizada pelo sequenciamento clássico de Sanger, utilizando-se o reagente BigDye Terminator v3.1™em equipamento ABI3500 e pela técnica de dPCR, na plataforma QuantStudio 3D e utilizando-se o ensaio Taqman LiqBiopsy Digital Hs0000000039_rm. As amostras foram testadas em duplicatas e quando a frequência alélica estava próxima de 0,1%, em triplicatas. Resultados: Pelo método do sequenciamento de Sanger a mutação D816V foi detectada em apenas uma amostra. Já pela técnica da dPCR, a mutação foi detectada em 14 amostras, sendo que a média da frequência alélica foi de 2,1% (0,15% – 6,79%), sendo que houve boa concordância entre as replicadas. Das 4 amostras testadas em triplicatas, a presença da mutação foi confirmada em 2, com uma frequência alélica média de 0,15% (0,14% - 0,16%). Discussão: A MS tem origem na proliferação clonal de mastócitos anormais em órgãos extra-cutâneos. A apresentação clínica da MS é heterogênea, variando da doença indolente até uma variante mais agressiva. Atualmente, a Organização Mundial da Saúde classifica a mastocitose como uma categoria distinta de doença e mutações do gene KIT, particularmente a mutação D816V ocorre em quase todos os casos, independentemente do subtipo, sendo, desta forma, um marcador importante para o diagnóstico da doença, além de alvo terapêutico. O dPCR se mostrou uma técnica sensível, frente ao sequenciamento de Sanger, capaz de detectar a mutação D816V em sangue periférico, descartando assim a necessidade de punção medular. Além disso, proporciona a quantificação absoluta da frequência alélica da mutação, com boa concordância entre as replicatas, o que é importante para a estratificação de risco. O protocolo é rápido, com possibilidade de liberar o resultado em até 5 dias, sendo que a montagem dos chips utilizados e a análise são as etapas mais trabalhosas. O custo do teste também é efetivo, especialmente quando comparado com outras técnicas de sensibilidade semelhante, como o NGS. Uma limitação encontrada é que nesta técnica a reação é específica para cada mutação, não abrangendo desta forma as demais mutações do gene KIT, como V560G, D815K, D816Y, D816F, D816H e D820G que também podem ser encontradas na MS em cerca de 5% dos casos, o que pode explicar os 2 casos negativos encontrados.