Исследование цитотоксического эффекта магниевых сплавов на клеточные культуры

Abstract

Актуальность. Имплантация металлического стента всегда сопровождается риском возникновения неблагоприятных событий, таких как долгосрочная дисфункция эндотелия, постоянное физическое раздражение стенки сосуда, хронические локальные воспалительные реакции, высокий риск тромбообразования и прочее. В связи с этим актуальна разработка биодеградируемых стентов, которые будут обеспечивать необходимую поддержку на период заживления стенки сосуда и полностью резорбироваться без негативного влияния. С этой точки зрения магниевые сплавы являются самыми подходящими ввиду относительно низкой коррозионной стойкости и высокой биосовместимости. Цель. Исследовать цитотоксическую активность различных сплавов на основе магния в условиях in vitro. Методы. Для исследования методом деформационных термообработок получены 7 образцов магниевых сплавов с различным пределом текучести: 1 — MgZnZr (ZK60) 310 МПа, 2 — MgZnCa (ZX10) 60 МПа, 3 — MgZnCa (ZX40) 130 МПа, 4 — MgYZn (WZ31) 300 МПа, 5 — MgYZn (WZ31) 275 Мпа, 6 — MgYZn (WZ20) 340 МПа, 7 — MgZnZr (ZK60) 180 МПа. Данные образцы предварительно инкубировались в культуральной среде для получения экстракта, который в дальнейшем тестировался на иммортализованных фибробластах человека. Для исследования цитотоксической активности экстрактов применялись следующие методы: микротетразолиевый тест, проточная цитофлюориметрия, световая микроскопия, измерение рН экстрактов. Результаты. По итогам микротетразолиевого теста экстракт образца 7 проявил выраженную цитотоксичность: средняя выживаемость клеток 48,2 ± 1,0%, слабый цитотоксический эффект проявил экстракт образца 5 — 81,4 ± 14,0%. Микроскопический анализ показал меньшую плотность клеток в поле зрения для образцов 5 и 7. Проточная цитофлюориметрия выявила значительное увеличение некротических клеток для образца 7 (8,25%), для образцов 1 и 5 отмечено небольшое усиление некроза клеток (3,449 и 3,626% соответственно). Наиболее высокие показатели рН среды отмечены для образцов 5 и 7 (pH = 8,5). Выводы. Результаты тестов in vitro на цитотоксичность доказывают, что состав магниевого сплава и тип деформационной термомеханической обработки напрямую влияют на величину клеточного некроза, морфологию клеток и pH среды. Введение В последнее время наблюдается значительный рост применения и активное внедрение биорезорбируемых и биосовместимых материалов в медицине [1–3]. Говоря об успешности развития эндоваскулярных методов лечения ишемической болезни сердца, его врожденных пороков, а также атеросклеротических поражений периферических артерий, следует отметить, что разработка и производство различных биорезорбируемых имплантатов являются одним из перспективных и активно развивающихся направлений. В качестве основы для изготовления данных изделий используют различные сплавы коррозионностойких металлов: нитинол, нержавеющую сталь, кобальт-хром. Однако постоянное присутствие металлического каркаса в сердечно-сосудистой системе человека имеет недостатки, которые ограничивают более широкое использование. К таковым относятся: долгосрочная дисфункция эндотелия, задержка повторной эндотелизации, высокий риск тромбо­образования, постоянное физическое раздражение стенки сосуда, хронические локальные воспалительные реакции, неспособность адаптироваться к росту у молодых пациентов и невозможность повторного хирургического вмешательства [4–8]. Если учесть, что основной эффект имплантации данных металлических устройств обеспечивается за счет эффекта каркаса, а ремоделирование и заживление участка, подверженного стентированию, происходит в течение 6–12 мес., то дальнейшее присутствие металлического устройства по истечении этого времени не дает никаких полезных эффектов [9]. Таким образом, разработка биорезорбируемых имплантатов, которые обеспечивают необходимую поддержку на период заживления сосудистой стенки и полностью резорбируются без побочных эффектов для организма, имеет большие перспективы и может стать четвертой революцией в эндоваскулярной хирургии. При анализе мировой литературы установлено, что биорезорбируемый сердечно-сосудистый имплантат должен соответствовать следующим характеристикам: биосовместимость продуктов биодеградации, оптимальное время полной резорбции, достаточная радиальная жесткость на период полной неоэндотелизации [10]. С данной точки зрения магний — наиболее подходящий металл ввиду приемлемых параметров коррозионной стойкости и биосовместимости как его самого, так и продуктов его деградации [11, 12]. Более того, для замедления скорости деградации и повышения прочности магний может быть легирован одним или несколькими элементами (редкоземельными металлами, цинком и др.) [13]. В настоящее время имеется большое количество различных сплавов на основе магния, а их состав чаще всего разрабатывают в зависимости от конкретной области применения. Требование биосовместимости резко сужает диапазон допустимых легирующих элементов, что исключает из составов биодеградируемых материалов таких металлов, как алюминий, никель и так далее. С учетом роста многообразия магниевых сплавов очевидно, что поиск наиболее оптимального состава продолжается наряду с недостаточной изученностью процессов их биосовместимости, биодеградации и резорбции. Всестороннее исследование вышеупомянутых процессов позволит существенно продвинуться в данном направлении и создать биорезорбируемый сердечно-сосудистый имплантат на основе магниевого сплава с оптимальными характеристиками, полностью отвечающими современным требованиям медицинских изделий. В настоящей статье представлены результаты исследований цитотоксической активности различных сплавов на основе магния в условиях in vitro. Методы Образцы сплавов на основе магния предоставлены ФГБОУ ВО «Тольяттинский государственный университет» совместно с ФГБУ «НМИЦ им. ак. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России для исследования цитотоксической активности. Условные обозначения, спецификация образцов и краткие сведения о видах применяемых деформационных обработок с указанием температурных режимов приведены в табл. 1. Для испытаний выбраны сплавы из трех систем легирования: Mg-Zn-Zr (ZK60), Mg-Zn-Ca (ZX10, ZX40) и Mg-Y-Zn (WZ20, WZ31). Все исследуемые сплавы относятся к категории биосовместимых и рассматриваются в качестве кандидатов для производства соответствующих имплантатов. Микроструктурой и механическими свойствами этих сплавов можно управлять в широких пределах путем деформационных термообработок. Для примера в табл. 1 приведены значения условного предела текучести на растяжение. Как можно видеть, данный параметр существенно отличается для выбранных сплавов. Подробно режимы обработки и получающиеся микроструктуры будут описаны в специально посвященной публикации. Краткую информацию об использованных технологиях можно найти в указанных статьях [14–17]. Для исследования цитотоксических свойств использованы следующие методы: микротетразолиевый (МТТ) тест — оценка общей токсичности сплавов; проточная цитофлюориметрия — определение наличия цитостатических свойств; световая микроскопия — оценка изменения морфологии клеток; измерение рН экстрактов — оценка влияния магния в составе сплава на кислотность среды. Все образцы предварительно инкубировались в культуральной среде для получения экстракта, который в дальнейшем тестировался на иммортализованных фибробластах человека. Иммортализованные фибробласты человека (ATCC number CRL-4058), использованные в качестве клеточной линии, культивировались в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco) без антибиотика в атмосфере 5% СО2 при 37 ºС и влажности 80%. Получение экстрактов из сплавов. Для исследования цитотоксической активности сплавов получены экстракты из предоставленных образцов, согласно ГОСТ ISO 10993-5-2011. Образцы помещались в лунки 6-луночного планшета с культуральной средой. При получении экстрактов сделана поправка на разную площадь поверхности. Минимальный объем среды, необходимый для экспериментов и использованный для наименьшего образца, составлял 3 мл. Для остальных объем среды рассчитывался пропорционально площади поверхности образца (табл. 2) [18]. Образцы инкубировались при 37 °С в течение 24 ч на орбитальном шейкере OS-20 (Biosan) с частотой 80 оборотов в минуту. Спустя 24 ч инкубации полученные экстракты инкубировали с клетками в МТТ-тесте (1 мл) и 6-луночных планшетах (2 мл), которые использовали для микроскопии и проточной цитофлюориметрии. МТТ-тест выполнялся по стандартной методике [19]. В 96-луночный планшет раскапывали по 100 мкл суспензии клеток (плотность 3×104 кл/мл). Клетки инкубировали в термостате в течение 24 ч для прикрепления. Затем среду заменяли на экстракт из сплавов. Для учета концентрационной зависимости экстракта были сделаны разведения в 2, 4, 6, 8 и 10 раз. Для каждого образца выполнено по 3 повторности. В качестве отрицательного контроля использована культуральная среда, в качестве положительного – цитотоксический агент доксорубицин. Спустя 24 часа инкубации к клеткам раскапывали краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид (Sigma) по 10 мкл в лунку (концентрация красителя 3 мг/мл PBS). Через 2 ч среду отбирали, а образовавшийся формазан растворяли в 100 мкл изопропанола (Sigma). Измерение проводили с помощью планшетного спектрофотометра MultiScan FC (ThermoFischer Scientific) на длине волны 620 нм. Итоговые результаты представлены в виде средней выживаемости клеток в % по результатам 3 измерений ± SEM. Микроскопический анализ. Выполнялся на прижизненных образцах клеток. Для этого клетки высаживали в лунки 6-луночного планшета (по 10 тыс. клеток в лунку) и инкубировали в термостате в течение 24 ч для прикрепления. Затем среду заменяли на экстракт из сплавов (по 2 мл в лунку). Клетки инкубировали в течение 24 ч, затем проводили микроскопический анализ с помощью инвертированного микроскопа AxioVert Observer.Z1 (Сarl Zeiss). Фотографии получены с помощью программного обеспечения Zen 2 (Сarl Zeiss). В качестве отрицательного контроля использовали культуральную среду, в качестве положительного – цитостатик митомицин. Проточная цитофлюориметрия. Выполнялась с помощью прибора AttuneNxT (ThermoFischer Scientific). После микроскопического анализа клетки из лунок снимали с помощью трипсина и дважды отмывали PBS по 1 мл. После второй отмывки клетки суспензировали в 1 мл PBS, окрашивали йодидом пропидия (ThermoFischer Scientific) и далее анализировали с помощью цитофлюориметра. Конечный результат представлен в виде соотношения живых и мертвых клеток при анализе не менее 60000 клеток. рН среды. Измерения проводились в Институте неорганической химии СО РАН с использованием прибора SevenCompact pH/Ion S220 (Mettler Tolledo). Результаты МТТ-тест выполнен для оценки общей цитотоксичности полученных экстрактов на иммортализованных фибробластах. Итоги представлены в виде средней выживаемости клеток в % по результатам трех измерений ± SEМ в табл. 3. Микроскопический анализ проведен для исследования изменений морфологии клеток после 24 ч инкубации с экстрактами (рис. 1). Проточная цитофлюориметрия выполнялась для уточнения механизма токсичности экстрактов (цитостатичность/цитотоксичность) с окрашиванием клеток йодидом пропидия. В случае цитостатического механизма доля мертвых клеток в популяции не увеличится, в случае усиления некроза должен наблюдаться существенный прирост процента мертвых клеток (окрашенных йодидом пропидия). Результаты представлены в виде доли некротических клеток в популяции при анализе не менее 60 тыс. клеток ниже и рис. 2. pH среды. Так как сплавы, содержащие магний, при взаимодействии с водой могут образовывать гидроксид и защелачивать среду, проведено измерение рН после инкубации экстрактов с клетками, результаты которого представлены ниже. Обсуждение Исследование посвящено оценке цитотоксичности семи магниевых сплавов, отличающихся между собой составом примесей и системой легирования. Наряду с изучением токсичности, мы исследовали и другие параметры, необходимые для оценки перспективности полученных сплавов для использования в сердечно-сосудистой хирургии: изменение морфологии клеток, степень их некротизации, изменение рН среды. Для этого из предоставленных магниевых сплавов мы получили экстракты с применением культуральной среды, которые использовали для оценки цитотоксичности. По итогам МТТ-теста показано, что экстракт образца 7 проявлял выраженную цитотоксичность, однако при разведении средой его негативное воздействие на клетки нивелировалось. Слабый токсический эффект проявился для образца 5. Образец 1 не проявил достоверной цитотоксичности, хотя тренд на негативный эффект можно отметить. Таким образом, из семи образцов выявлен лишь один относительно токсичный сплав, механизм действия которого проявился в увеличении доли некротических клеток: значительное усиление некроза отмечено при инкубации с экстрактом образца 7, что подтвердило его цитотоксический эффект. Для образцов 1 и 5 отмечено небольшое усиление некроза клеток. Также показано, что внешний вид клеток существенно не изменился при воздействии экстрактов, а визуально меньшая плотность клеток заметна в поле зрения для цитостатика митомицина, образцов 5 и 7. Наиболее высокие показатели рН среды отмечены для образцов 5 и 7, проявляющих цитотоксический эффект в разной степени. Для экстрактов наиболее токсичных образцов наблюдалось самое высокое значение рН, существенно выходящее за пределы физиологической нормы, что могло объяснить усиление некроза клеток после инкубации с экстрактом. Выводы Представленные результаты тестов in vitro на цитотоксичность доказывают, что состав магниевого сплава напрямую оказывает влияние на величину клеточного некроза, изменение морфологии клеток и pH среды. Все исследованные сплавы продемонстрировали отрицательный цитотоксический эффект, что позволяет рассматривать их в качестве кандидатов для изготовления биорезорбируемых имплантатов. Цитотоксичность, проявляемая образцами 5 и 7, относится, скорее всего, не к системе легирования, а к его химической чистоте и наличию вредных примесей. В каждой группе сплавов присутствуют образцы, демонстрирующие превосходное соотношение прочности и отрицательной цитотоксичности (образцы 1 — ZK60, 3 — ZX40, 6 — WZ20), что позволяет рационально выбирать оптимальную деформационную термомеханическую обработку для получения заданной микроструктуры в интересующей группе сплавов. Углубленный анализ и сопоставление полученных результатов с данными о составе и структуре сплавов, коррозионными и механическими свойствами и дальнейшее исследование образцов в эксперименте in vivo на лабораторных животных позволят выявить дополнительные связи между характеристиками образцов и их биологической активностью. Конфликт интересов Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование Работа выполнена при поддержке Министерства науки РФ в рамках проекта RFMEFI58317X0070.

Keywords

• биодеградируемый стент
• биосовместимость
• артерии нижних конечностей
• ишемическая болезнь сердца
• магниевый сплав
• эндоваскулярная хирургия