IMPACTO DO SILENCIAMENTO DAS PROTEÍNAS RHOA E RHOC NA NA AQUISIÇÃO DE DANOS AO DNA E MORTE DE CÉLULAS MIELOIDES U937 TRATADAS COM UVC

Abstract

Introdução: RhoA e RhoC são proteínas RHO GTPases homólogas que desempenham papéis cruciais na regulação de processos celulares, incluindo a apoptose e a resposta ao dano no DNA. Compreender as funções específicas dessas proteínas em resposta ao estresse genotóxico é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, inclusive em em leucemias mieloides, já que o mecanismo de resistência a danos no DNA está associado a eficácia dos tratamentos. Objetivos: Comparar o impacto do silenciamento de RhoA e RhoC na indução de dano no DNA e apoptose de células leucêmicas. Material e métodos: Células da linhagem U937 foram silenciadas para RhoA (shRHOA) e RhoC (shRHOC) utilizando vetores lentivirais. O silenciamento foi confirmado por PCR em tempo real e western blot. O estresse genotóxico foi induzido através da exposição celular a 10J/m2 de UV-C e coletadas nos tempos de 2, 6 e 24 horas. A expressão de γH2AX (marcador de DNA) e apoptose (marcação de anexina V e iodeto de propideo) foram avaliadas por citometria de fluxo. Resultados: Observamos uma redução efetiva na expressão gênica e proteica (aproximadamente 85%) de RHOA e RHOC nas células U937 shRHOA e shRHOC, respectivamente. As células silenciadas para RHOA apresentaram aumento da expressão de γH2AX (4,8% de células positivas) e nos níveis de apoptose em comparação as células controle. Conforme o esperado, a expressão de γH2AX aumentou nas células controle a partir de 6 horas após a exposição à UV-C (aproximadamente 70% de células positivas). Nas células shRHOA e shRHOC houve menor aumento de expressão de γH2AX 34.8% e 29.3% de células positivas, respectivamente. Além disso, a exposição a UVC induziu uma maior porcentagem de células shRHOA em apoptose tardia em comparação às células shCTRL. Nas células shRHOC, por sua vez, a exposição a UVC pareceu induzir o processo de necrose. Discussão e conclusão: O silenciamento de RHOA por si (e não RHOC) causou danos ao DNA mas não houve alterações na apoptose em células U937. Porém, um efeito protetor à indução de danos ao DNA foi observado quando células silenciadas para RHOA ou RHOC foram expostas a UVC, o que pode estar relacionado a diferenças encontradas na morte celular. O aumento da necrose induzida nas células shRHOC, contraditória ao seu aparente efeito protetor, talvez esteja relacionada ao processo de reconhecimento dos danos para os reparos, induzindo a necrose imediata. Estes resultados indicam que ambas as proteínas participam de maneiras únicas na resposta nos danos induzidos por UVC em células mieloides. Financiamento: FAPESP.