AVALIAÇÃO DO ESTÍMULO DO PMA NA QUANTIFICAÇÃO DE NETS, TLR2 E TLR4 EM CRIANÇAS COM DOENÇA FALCIFORME

Abstract

Objetivo: Avaliar a quantificação de armadilhas extracelulares de neutrófilos, TLR2 e TLR4 em crianças com doença falciforme, após estímulo com PMA. Metodologia: Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (CEP – HC UFTM). O grupo de estudo foi composto por 25 crianças com idades de 1 a 13 anos, diagnosticadas com doença falciforme, atendidas no Ambulatório de Hematologia e Hemoterapia do Hemocentro Regional de Uberaba/MG. Foi coletado sangue periférico, por venopunção, em tubos contendo heparina. O isolamento de neutrófilos foi realizado por meio de centrifugação em gradiente de concentração por Ficoll-Paque™. Os neutrófilos isolados foram mantidos por 4 horas em incubadora úmida a 37°C em meio RPMI-1640 contendo 10% de soro fetal bovino, com e sem estímulo por PMA (phorbol myristate acetate). Posteriormente, as amostras foram marcadas com Sytox Green e CD66a para quantificação da netose; CD66a e marcador TLR2 para quantificar o receptor TLR2 e CD66a e marcador TLR4 para quantificar o receptor TLR4. As quantificações da netose e dos receptores foram realizadas por citometria de fluxo em citômetro FACSCanto II. A análise estatística foi realizada utilizando o programa GraphPad Prism e a significância estatística foi definida como p < 0,05. Resultados: O estudo foi composto por 13 (52%) crianças do sexo masculino e 12 (48%) feminino, com mediana de idade de 7 anos (1 – 13). Em relação aos genótipos ,: 11 (44%) crianças apresentavam genótipo HbSS, 10 (40%) genótipo HbSC e 4 (16%) outros genótipos. Houve diferença estatística (p = 0,0001) na avaliação da netose, sendo observada maior expressão no grupo de amostras tratadas com PMA em relação ao grupo de amostras não tratadas. Houve diferença estatística (p = 0,0015) na quantificação do receptor TLR2, sendo observada maior quantidade desse receptor no grupo de amostras tratadas com PMA em relação ao grupo de amostras não tratadas. Houve diferença estatística (p = 0,002) na quantificação do receptor TLR4, sendo observada maior quantidade de receptor TLR4 no grupo de amostras tratadas em relação ao grupo de amostras não tratadas. Discussão: A doença falciforme é um distúrbio hematológico caracterizado por um processo inflamatório crônico. Tem sido demonstrado que a adesão de células falciformes e neutrófilos ao endotélio colaboram com a vaso-oclusão observada em indivíduos com a doença. Estudos apontam que a alta atividade dos neutrófilos em processos infecciosos nestes pacientes, induz a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETS), influenciando na iniciação e evolução de trombos, bem como a ativação de TLR2 e TLR4. A ativação desses dois receptores é capaz de produzir citocinas e moléculas de adesão importantes na inflamação, mas que de maneira exacerbada podem levar a vaso-oclusão. No presente estudo, foi observada maior expressão de netose, TLR2 e TLR4 nas amostras estimuladas pelo PMA. A literatura relata que o PMA induz notavelmente vias semelhantes a outros estímulos, sendo considerado um bom estímulo artificial para estudos com neutrófilos, conforme demonstrado no presente estudo. Conclusão: Os resultados desse estudo sugerem que o PMA é eficaz no papel de estimulador de netose, TLR2 e TLR4.