A FORMAÇÃO DE ARMADILHAS EXTRACELULARES DE NEUTRÓFILOS (NETS) PARECE ESTAR AUMENTADA AO DIAGNÓSTICO E REDUZIR EM RESPOSTA À TERAPIA EM PACIENCTES COM MIELOMA MÚLTIPLO

Abstract

Introdução: As armadilhas extracelulares de neutrófilos (neutrophil extracelular traps - NETs) são estruturas extracelulares que neutralizam patógenos para prevenir infecções. Porém, NETs também são envolvidas como mediadores de processos inflamatórios não infecciosos, como câncer. A inflamação é um fator crítico no mieloma múltiplo (MM) e a formação de NETs tem mostrado um papel significativo na progressão da doença. Porém, o papel de NETs no MM ainda não foi elucidado. Objetivo: Comparar a formação de NETs no sangue periférico de pacientes com MM e doadores sadios. Metodologia: Foram utilizadas amostras de sangue periférico coletadas de quatro pacientes ao diagnóstico de MM e três pacientes responsivos à terapia combinada de bortezomibe, talidomida e dexametasona (VTD). Amostra de sangue coletada de doador sadio com idade pareada (54 anos) foi utilizada como controle. Os neutrófilos foram isolados de sangue periférico através de gradiente de ficoll-hypaque. A pureza da separação foi avaliada por citometria de fluxo com os marcadores CD66b (neutrófilos), CD3/CD19 (linfócitos T/B) e CD14 (monócitos). A formação de NETs foi induzida ou não através de tratamento in vitro com Phorbol-12-miristato-13-acetato (PMA) por 3 horas. NETs foram identificados através de microscopia confocal utilizando marcador nuclear (NucBlue) e anticorpos anti-histona e anti-elastase. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNICAMP. Resultados: O grau de pureza da separação dos neutrófilos foi de 80-97%, observado pela marcação de CD66b e ausência de expressão de marcadores de linfócitos e monócitos. Três concentrações de PMA foram incialmente testadas para indução de NETs (10M, 25M 50M) e a maior dose foi mais efetiva e escolhida para os ensaios subsequentes. Observamos baixa presença de NETs na amostra controle, enquanto três das quatro amostras de pacientes com MM coletadas ao diagnóstico apresentaram maior presença de NETs. Interessantemente, os três pacientes com MM que responderam à terapia apresentaram baixa formação de NETs. O tratamento in vitro dos neutrófilos com PMA induziu a formação de NETs tanto na amostra controle quanto nas amostras de pacientes (ao diagnóstico ou sob tratamento). Discussão e conclusão: : Sabe-se que a desregulação de NETs pode contribuir com a patogênese de neoplasias. Nossos resultados sugerem que a formação de NETs está aumentada nos pacientes com MM no momento do diagnóstico em comparação aos doadores sadios. Além disso, a formação de NETs parece estar reduzida nos pacientes responsivos à terapia. Porém, ao contrário do que já foi reportado em outras neoplasias, o tratamento in vitro dos neutrófilos com PMA foi efetivo na indução de NETs nos pacientes com MM. Financiamento: CAPES e FAPESP.