Anais da Academia Brasileira de Ciências (Dec 2002)
A yeast-based model system for cloning secreted and membrane proteins
Abstract
The targeting of proteins to cell organelles and membranes, or of proteins destined to secretion, is coordinated by signal sequences located at the 5´-end of their respective genes. A signal sequence trap system was envisaged in which a truncated version of the yeast acid phosphatase pho5 gene lacking the start codon and signal sequence could serve as a reporter gene. A fraction enriched in 5´-end fragments obtained by PCR from a potato guard-cell cDNA library was cloned in frame to the acid phosphatase gene and the acid phosphatase activity was assayed directly in yeast colonies grown on selective medium. Putative signal sequences targeting the acid phosphatase to the membrane or to the outside of the cell were used to screen the cDNA bank in order to recover the original full-size sequence which gave rise to the signal sequence. Two unknown sequences displaying marked tissue-specific expression were retrieved, one of them (YE139) with a higher expression level in green buds and stem cells, and the other one (YE290) with a higher expression level in androceum, gyneceum, and roots. The limitations of the system are further analyzed using other sequences as control.O direcionamento de proteínas a organelas e à membrana celular, ou de proteínas a serem secretadas, é coordenado por seqüências sinalizadoras localizadas na extremidade 5´ de seus respectivos genes que codificam peptídeos-sinal. Este trabalho analisa um sistema para seleção de seqüências sinalizadoras utilizando uma fosfatase ácida de levedura, enzima reconhecidamente secretada por estes organismos, desprovida de seu códon de iniciação e de sua seqüência sinalizadora, como gene repórter. Uma fração enriquecida em fragmentos provenientes da região 5´ de uma biblioteca de cDNA de células-guarda de batata foi inserida in frame ao gene truncado da fosfatase ácida em vetores apropriados. Após a transformação em leveduras, a atividade da fosfatase ácida foi medida diretamente sobre colônias crescidas em meio seletivo. A seqüência nucleotídica dos prováveis peptídeos-sinal capazes de direcionar aquela enzima ao exterior celular foram utilizadas como sondas para recuperação da seqüência original da biblioteca de cDNA. Dois clones sem homologia conhecida, mas apresentando forte expressão tecido-específica, foram obtidos, um deles (YE139) com expressão acentuada em botões florais verdes e células do tronco, e o outro (YE290) de expressão elevada em androceu, gineceu e raízes. Os diversos problemas encontrados durante a execução do trabalho são discutidos face aos resultados obtidos com outras proteínas-modelo.
Keywords
