بررسی ویرایش ژن DAZL در ژنوم رویان بز بختیاری با استفاده از CRISPR/Cas9 و تکنیک های انتقال هسته سلول سوماتیک

Abstract

CRISPR/Cas9 در حال ایجاد تغییرات در مهندسی ژنوم و ویژگی­های مختلف دام به­ویژه صفات اقتصادی است. DAZL یک پروتئین حفاظت شده متصل به RNA است که برای تمایز و توسعه سلول­های زایا، ضروری است. نرهای ناک اوت شده برای این ژن، قادر به تولید اسپرم نیستند. هدف از این مطالعه، ایجاد رویان بز ناک اوت برای ژن DAZL بود. با استفاده از gRNA طراحی شده در وکتور PX459، پلاسمیدها ساخته و کلون شدند. پلاسمید نوترکیب با استفاده از روش الکتروپوریشن به سلول­های فیبروبلاست منتقل شده و سلول­های ترانسفکت شده با تیمار پورمایسین انتخاب شدند. سلول‌های ویرایش شده از مسیر روند انتقال هسته سلول سوماتیک (شبیه­سازی)، به تخمک‌های بدون هسته متصل شده و سپس، همجوشی الکتریکی غشای سلولی اعمال شد. رویان­های حاصل از روند شبیه­سازی از نظر مراحل رویانی و رسیدن به مراحل تسهیم و بلاستوسیست بررسی شدند. نتایج بررسی بیان ژن، موفقیت تکنیک CRISPR/Cas9 برای سرکوب ژن DAZL را نشان داد. نرخ تکوین بلاستوسیت حاصل از روند شبیه­سازی با سلول­های ناک اوت شده، تفاوت قابل توجهی با گروه شاهد نداشت. با کمک بررسی توالی­یابی ژنتیکی، میزان ناک اوت ژن DAZL در سلول فیبروبلاست، 3/83 و در بلاستوسیست‌های حاصل از شبیه­سازی، 3/55 درصد به­دست آمد. جهش ­ها از نوع INDEL و همگی به­شکل تغییر قالب خوانش پروتئین بودند که منجر به تغییر پروتئین می­شود. بلاستوسیت‌های تولید شده را می­توان برای انتقال به حیوان گیرنده و تولید بزهای ناک اوت شده برای ژن DAZL برای مطالعات بیشتر و بهینه­‌سازی پیوند سلول­های بنیادی اسپرماتوگونیال استفاده کرد.

Keywords

• الکتروپوریشن
• بز ناک اوت
• تکنیک crispr/cas9
• ترانسفکت
• ژن dazl