GENES DE REFERÊNCIA PARA ESTUDOS DE EXPRESSÃO RELATIVA POR QPCR EM ISOLADOS DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE

Abstract

Introdução/Objetivo: Isolados de Klebsiella pneumoniae resistentes à multiplas drogas têm sido extensivamente reportados em todo o mundo. Alguns determinantes de resistência tornaram-se mais preocupantes pela sua disseminação, como o gene blakpc, já reportado em cepas com altos níveis de resistência aos carbapenêmicos. Em determinados contextos, esse fenômeno é atribuído a mecanismos adicionais, como por exemplo, a regulação da expressão desse gene. Esse trabalho avaliou a estabilidade da expressão de genes candidatos a controles endógenos em K. pneumoniae para aplicação em estudos de expressão relativa por qPCR. Métodos: Foram pré-selecionados vinte e um pares de iniciadores candidatos a controles endógenos, submetidos a análises in sílico, avaliando-se: amplificação nos principais grupos clonais de K. pneumoniae; tamanho do fragmento; temperatura de melting e formação de estruturas secundárias. Os primers foram validados pelo método de curva padrão. O RNA foi extraído usando TRIzol® e o cDNA, sintetizado com o Kit EasyScript™. As reações de qPCR foram realizadas no equipamento StepOneTM, com o fluoróforo SYBR® Green. Foram utilizados isolados clínicos com distintos perfis de susceptibilidade aos carbapenêmicos para testar a estabilidade dos genes frente a exposição com antimicrobiano. Os dados foram analisados no software BestKeeper. Resultados: Os primers para os genes proC, rpoC, rho, tuf e rpoB foram validados. Após análises no BestKeeper, os genes rpoC, rpoB, proC e rho, foram categorizados como os mais estáveis. A expressão relativa do gene blaKPC, normalizada com os distintos controles endógenos, mostrou resultados semelhantes, indicando que os genes selecionados são bons normalizadores para estudos de expressão. O isolado com maior concentração inibitória mínima (CIM) para os carbapenêmicos, apresentou maiores níveis de expressão quando comparado ao isolado com menor CIM, utilizando os genes rpoC, rpoB e proC como controles endógenos. Conclusão: Evidencia-se a importância de avaliar criteriosamente os primers descritos na literatura como etapa anterior às análises de expressão relativa, pois a estabilidade dos genes está associada a condição imposta nas análises e pode gerar resultados não-válidos, além de equívocos de entendimento dos fenótipos. Estudos de estabilidade dos genes de controles endógenos em distintas condições são de suma importância para a confiabilidade dos resultados de qPCR.

Keywords

• qPCR Controles endógenos Resistência bacteriana a antibióticos