Sekuensing 16S DNA Bakteri Selulolitik Asal Limbah Cairan Rumen Sapi Peranakan Ongole (SEQUENCING OF 16S DNA OF CELLULOLYTIC BACTERIA FROM BOVINE RUMEN FLUID WASTE ONGOLE CROSSBREED)

Abstract

This study aimed to identified cellulolytic inoculant code WPL 214 isolated from bovine rumen fluid waste of Ongole Cross Breed of Surabaya Slaughter house. A single colony of isolates celulolytic grown on 5 mL of liquid media Luria Bertani (LB) consist of 1 % NaCl , 1% tripton , 0.5 % yeast extract, containing1 % carboxymethyl cellulose (CMC) at temperature 37°C, using a shaker of incubator during 16-18 hours. That isolate determined by 16S DNA gen analysis using High Fidelity Platinum Taq DNA Polymerase with primer forward PB36 5’-AGR GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’ and primer reverse PB38 5’-GMT ACCTTG TTA CGA CTT-3’ for PCR. Nucleotide sequence of 16S DNA fragment was determined through the sequencing method. The result was then compared with GenBank database to recognize the type of the sample bacteria. DNA isolation and 16S DNA coding genes amplification were carried out using Kit High Fidelity Platinum Taq DNA Polymerase. Afterward, BLAST was applied to identify the phylogenetic tree. The bacteria was capable of indicating the existence of clear zone in a media CMC by congo red staining. The existence of the clear zone associated with the activity of microbes to degrade cellulose. The conclusión of this research based on the results was the sequencing nucleotides genome 16S DNA showed that cellulolytic inoculant was identified as Enterobacter cloacae WPL 214. ABSTRAK Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi lebih lanjut isolat selulolitik kode WPL 214 yang telah diisolasi dari cairan rumen sapi peranakan ongole dari limbah Rumah Potong Hewan Surabaya. Koloni tunggal dari isolat selulolitik ditumbuhkan pada 5 mL media cair Luria Bertani (LB) dengan komposisisi 1% NaCl, 1% tripton, 0,5% yeast ekstrak, yang mengandung 1% substrat carboxymethyl cellulose (CMC) pada suhu 37°C, dengan pengocokan menggunakan shaker incubator selama ±16-18 jam. Penelitian ini terdiri dari dua tahap, tahap pertama dilakukan isolasi DNA, tahap kedua dilakukan identifikasi gen penyandi 16S DNA, amplifikasi DNA dengan polymerase chain reaction (PCR). Amplifikasi gen penyandi 16S DNA menggunakan Kit High Fidelity Platinum Taq DNA Polymerase dengan primer forward PB36 5’-AGR GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’ dan primer reverse PB38 5’-GMT ACC TTG TTA CGA CTT-3’ yang digunakan untuk PCR. Hasil sekuensing nukleotida dari 16S DNA selanjutnya dibandingkan dengan urutan nukleotida dari GenBank database untuk dilakukan BLAST untuk mengidentifikasi berdasarkan pohon filogeni. Bakteri tersebut mampu menunjukkan adanya zona bening pada media Carboxymethyl cellulose (CMC) dengan pewarnaan congo red. Adanya zona bening tersebut berhubungan dengan aktivitas mikrob untuk mendegradasi selulosa. Simpulan penelitian menunjukkan bahwa berdasarkan hasil urutan nukleotida genom 16S DNA serta pohon filogeni, maka isolat selulolitik tersebut diidentifikasi sebagai Enterobacter cloacae WPL 214.

Keywords

• cellulolytic bacteria
• PCR
• sequencing
• phylogenetic tree