Investigation of dose-dependent effects of berberine against renal ischemia/reperfusion injury in experimental diabetic rats

Abstract

Background: Ischemia–reperfusion injury causes various severe morphological and functional changes in diabetic patients. To date, numerous antidiabetic and antioxidant agents have been used for treatment of the disease-related changes. Objectives: We aimed to examine effective therapeutic doses or doses of berberine against renal ischemia/reperfusion injury (IRI) in a streptozotocin (STZ)-induced diabetic rat model by histopathological and biochemical analysis. Methods: Thirty male Sprague Dawley rats were treated with STZ injection for the development of diabetes, and divided into the following groups: STZ-induced diabetic group (STZ); IRI-induced diabetic group (STZ + IRI); 50 mg/kg berberine (BRB) treated diabetic group after inducing IRI (STZ + IRI + BRB1); 100 mg/kg BRB treated diabetic group after IRI (STZ + IRI + BRB2); 150 mg/kg BRB treated diabetic group after IRI (STZ + IRI + BRB3). Bilateral renal ischemia model was applied for 45 min, then reperfusion was allowed for 14 days in STZ-induced diabetic rats. Renal injury was detected histopathologically. Blood urea nitrogen (BUN), creatinine and lactate dehydrogenase (LDH) levels were measured in serum using the ELISA method. Total antioxidant status (TAS) and total oxidant status (TOS) of renal tissue was studied by spectrophotometric assay. Oxidative stress index (OSI) was calculated as TOS-to-TAS ratio. Tumor necrosis factor alpha (TNF-α), C-reactive protein (CRP), Na+/K+-ATPase (sodium pump), and Ca2+-ATPase (calcium ATPase) enzyme levels were measured in tissues using the ELISA method. Anti-apoptotic Bax and pro-apoptotic Bcl-2 protein levels were detected by Western blot analysis. All data were evaluated statistically. Results: The highest histopathological score was detected in the STZ + IRI group compared to the other group. BRB administration at the doses of 100 mg/kg and 150 mg/kg markedly improved renal injury. BUN and creatinine levels significantly increased in the STZ + IRI group compared to the STZ group (p < 0.001). 100 mg/kg and 150 mg/kg BRB administration significantly decreased those levels (p < 0.01). The highest TOS and the lowest TAS levels were detected in the STZ + IRI group (p < 0.001). IRI markedly aggravated inflammation via increasing levels of TNF-α and CRP (<0.001), and caused apoptosis via inducing Bcl-2 protein, and suppressing Bax protein (p < 0.001). BRB administration at the doses of 100 mg/kg and 150 mg/kg showed anti-oxidant, anti-inflammatory and anti-apoptotic effects (p < 0.01). The LDH enzyme, was used as a necrosis marker, was higher in the STZ + IRI group than other groups. BRB administration at all of the doses, resulted in the decline of LDH enzyme level (p < 0.001). Ca2+-ATPase and Na+/K+-ATPase enzyme activities decreased in the STZ + IRI group compared to the STZ group (p < 0.001), while BRB administration at the doses of 100 mg/kg and 150 mg/kg significantly increased those of enzyme activities, respectively (p < 0.05). Conclusion: Ischemia with diabetes caused severe histopathological and biochemical damage in renal tissue. The high doses of berberine markedly improved histopathological findings, regulated kidney function via decreasing BUN and creatinine levels, and rearranged intercellular ion concentration via increasing Na+/K+-ATPase and Ca2+− ATPase levels. Berberine showed anti-oxidant, anti-apoptotic, and anti-inflammatory effects. According to these data, we suggest that berberine at the doses of 100 and 150 mg may be used as a potential therapeutic agent to prevent renal ischemic injury. Resumen: Antecedentes: La reperfusión de la isquemia provoca graves cambios morfológicos y funcionales en los pacientes diabéticos. Hasta la fecha numerosos antidiabéticos y agentes antioxidantes han sido utilizados para el tratamiento de los cambios relacionados con la enfermedad. Objetivos: El objetivo fue examinar las dosis terapéuticas efectivas o las dosis de berberina (BRB) frente a la insuficiencia renal por isquemia/reperfusión (IRI) en estreptozotocina (STZ) inducida por el modelo de rata por análisis histopatológico y bioquímico. Métodos: Treinta ratas machos Spraque-Dawley fueron tratadas con inyección de STZ para el desarrollo de diabetes, se dividieron en los siguientes grupos: grupo diabético inducido por STZ; grupo diabético inducido por IRI (STZ + IRI); grupo diabético tratado con 50 mg/kg de BRB después de la inducción de IRI (STZ + IRI + BRB1); grupo diabético tratado con 100 mg/kg de BRB después de IRI (STZ + IRI + BRB2), y grupo diabético tratado con 150 mg/kg de BRB después de IRI (STZ + IRI + BRB3). Se aplicó un modelo de isquemia renal bilateral durante 45 min, luego se permitió la reperfusión durante 14 días en ratas diabéticas inducidas por STZ. La lesión renal fue detectada histopatológicamente. Los niveles de nitrógeno ureico en sangre (BUN), creatinina y lactato deshidrogenasa (LDH) se midieron en suero por el método ELISA. El estado antioxidante total (TAS) y el estado oxidante total (TOS) del tejido renal se estudiaron mediante un ensayo espectrofotométrico. El índice de estrés oxidativo (OSI) fue calculado como la relación TOS-a-TAS. El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), proteína C reactiva (CRP), Na+/K+-ATPasa (bomba de sodio) y la Ca2+-ATPasa (calcio ATPasa) de la enzima se midieron los niveles en los tejidos mediante el método ELISA. Los niveles de proteína anti-apoptótica Bax y pro-apoptótica Bcl-2 se detectaron por el análisis de Western blot. Todos los datos fueron evaluados estadísticamente. Resultados: La mayor puntuación histopatológica fue detectada en el grupo STZ + IRI en comparación con el otro grupo. La administración de BRB en dosis de 100 y 150 mg/kg mejoró notablemente la lesión renal. Los niveles de BUN y creatinina aumentaron significativamente en el grupo STZ + IRI en comparación con el grupo STZ (p < 0,001). La administración de 100 y 150 mg/kg de BRB disminuyó significativamente esos niveles (p < 0,01). Los TOS más altos y los niveles más bajos de TAS se detectaron en el grupo STZ + IRI (p < 0,001). El IRI agravó notablemente la inflamación a través del aumento de los niveles de TNF-alfa y de PCR (< 0,001), y causó la apoptosis a través de la inducción de la proteína Bcl-2 y la supresión de la proteína Bax (p < 0,001). La administración de BRB con las dosis de 100 y 150 mg/kg mostró efectos antioxidante, antiinflamatorio y antiapoptóticos (p < 0,01). La enzima LDH que se usó como marcador de necrosis fue mayor en el grupo STZ + IRI que en los otros grupos. La administración de BRB en todas las dosis, dio lugar a una disminución del nivel de la enzima LDH (p < 0,001). Las actividades de las enzimas Ca2+-ATPasa y Na+/K+-ATPasa disminuyeron en el grupo STZ + IRI en comparación con el grupo STZ (p < 0,001, mientras que la administración de BRB en dosis de 100 y 150 mg/kg incrementó significativamente las actividades de las enzimas, respectivamente (p < 0,05). Conclusión: La isquemia con diabetes causó graves daños histopatológicos y bioquímicos en el tejido renal. Las altas dosis de BRB mejoraron notablemente los hallazgos histopatológicos, la función renal regulada a través de la disminución de los niveles de BUN y creatinina, y la concentración de iones intercelulares reordenados mediante el aumento de los niveles de Na+/K+-ATPasa y la Ca2+-ATPasa. La BRB mostró efectos antioxidantes, antiapoptóticos y antiinflamatorios. De acuerdo con estos datos, sugerimos que la BRB en dosis de 100 y 150 mg se puede usar como un agente terapéutico potencial para prevenir la lesión isquémica renal. Keywords: Renal ischemia/reperfusion injury, Berberine, Histopathology, Oxidative stress, Apoptosis, Inflammation, Palabras clave: Insuficiencia renal por isquemia/reperfusión, Berberina, Histopatología, Estrés oxidativo, Apoptosis, Inflamación