ESTUDO DO PAPEL DE DNMT3A E TDT NA PROMOÇÃO DE MUTAÇÕES EM FLT3 E NPM1 NA LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA

Abstract

Introdução e objetivos: A leucemia mieloide aguda (LMA) é uma neoplasia maligna do tecido hematopoiético, na qual células precursoras da linhagem mieloide adquirem uma série de mutações que bloqueiam seus programas de diferenciação e maturação. A etiologia da doença está associada a uma paisagem genômica altamente heterogênea, na qual alterações nos genes FLT3 e NPM1 destacam-se por seu impacto no prognóstico clínico. Mutações nestes genessão identificadas em 25% e 33% dos pacientes com LMA e parecem atuar sinergicamente na manutenção do estado leucêmico. Em 2019, um grupo de pesquisadores propôs que a enzima desoxinucleotidil-transferase terminal (TdT) fosse responsável pela formação de pequenas inserções ou duplicações nos genes FLT3 (FLT3-ITD) e NPM1 (NPM1c). Essas alterações estão associadas a outras mutações pré-existentes nas células, em especial as que afetam o gene DNMT3A. Como essa DNA metiltransferase pode regular a expressão gênica na célula, nós buscamos investigar se mutações em DNMT3A podem contribuir para a desregulação da expressão de TdT e, com isso, facilitar a ocorrência de mutações em FLT3 e NPM1 na patogênese molecular da LMA. Material e métodos: Este trabalho foi desenvolvido primeiramente em uma coorte exploratória obtida a partir de dados do TCGA (The Cancer Genome Atlas) e uma segunda etapa foi conduzida em uma coorte de validação, a partir de amostras de medula óssea e ou sangue periférico para obter DNA e RNA de pacientes diagnosticados com LMA. Os DNA ’s extraídos foram amplificados por PCR convencional para a identificação de inserções nos genes FLT3 (éxon 14) e NPM1 (éxon 12), além de mutações em DNMT3A (éxons 19 e 23). As microinserções em NPM1 e FLT3 foram identificadas por análise de fragmentos e sequenciadas nos casos positivos. Mutações pontuais em DNMT3A foram identificadas por sequenciamento de Sanger. Em seguida, as análises de RT-qPCR foram realizadas para quantificar os níveis transcricionais de TdT nas amostras e correlacioná-los ao status mutacional dos genes. Resultados: Foram incluídos 200 indivíduos adultos (18 e 88 anos) com LMA da coorte do TCGA. A grande maioria (56%) do sexo masculino. Mutações nos genes FLT3, NPM1 e DNMT3A foram identificadas em 28%, 27% e 26% dos pacientes, respectivamente. Ao avaliar os níveis de expressão gênica e de metilação de DNTT entre os diferentes subtipos de LMA, notamos que estas variáveis sofrem mais variações entre os subtipos mais imaturos (M0-M4). Devido a essa observação, decidimos proceder com as análises seguintes somente para as amostras destes subgrupos. Indivíduos portadores de mutações em DNMT3A apresentaram maiores níveis de metilação dentro da região correspondente ao éxon 1 do gene DNTT em comparação a indivíduos selvagens (p = 0.03). O mesmo resultado foi observado para essa região do gene em pacientes mutados para FLT3 (p = 0.04) eNPM1 (p = 0.0001). Pacientes mutados para DNMT3A e NPM1 apresentaram níveis transcricionais de DNTT mais reduzidos em comparação a pacientes selvagens. Conclusão e perspectivas: Mutações em DNMT3A foram associadas a maiores níveis de metilação e consequentemente expressão de TdT. Esse resultado pode estar sugerindo a existência de outros mecanismos por trás da regulação da expressão de TdT em LMA.