Veterinaria Italiana (Jun 2010)
Sviluppo e valutazione preliminare di una real-time PCR per l’identificazione di Culicoides obsoletus sensu strictu, C. scoticus e C. montanus all’interno del complesso Obsoletus in Italia
Abstract
Oggetto dello studio è la messa a punto di un metodo PCR real time che utilizza il Power SYBR Green come colorante fluorescente intercalante, seguito dall’analisi delle curve di melting in fase di post-amplificazione. La sequenza target è l’Internal Transcribed Spacer 2 (ITS2) del DNA ribosomiale e rappresenta l’evoluzione della metodica tradizionale PCR gel-based utilizzata per identificare tre differenti specie di Culicoides incluse nel cosiddetto Obsoletus complex. Con il metodo sviluppato sono stati analizzati centoquaranta Culicoides morfologicamente classificati come appartenenti all’Obsoletus complex, e i risultati confrontati con quelli ottenuti combinando l’identificazione morfologica con PCR su gel. Mediante l’analisi del pattern specie-specifico delle curve di dissociazione, è stato possibile identificare tra gli insetti 52 C. scoticus, 82 C. obsoletus sensu strictu e 6 C. montanus. Questi risultati concordano con quelli ottenuti combinando l’identificazione morfologica con la PCR gel-based che rappresenta il metodo impiegato di routine nelle attività diagnostiche del piano di sorveglianza entomologico della Bluetongue. Considerando la flessibilità diagnostica, la rapidità, la possibilità di automazione, il più elevato livello di qualità ed espressione dei risultati, la PCR real time ITS2 ha dimostrato di essere più funzionale ed efficace rispetto alla PCR su gel, soprattutto nell’ambito di un’estesa attività di monitoraggio.
