How Molecular Evolution Technologies can Provide Bespoke Industrial Enzymes: Application to Biofuels Comment les technologies d’évolution moléculaire peuvent fournir des enzymes industrielles sur mesure : application aux biocarburants

Abstract

Enzymatic hydrolysis of lignocellulose is one of the major bottlenecks in the development of biological conversion of lignocellulosic biomass to biofuels. One of the most efficient organisms for the production of cellulolytic enzymes is the fungus Trichoderma reesei, mainly thanks to its high secretion capacity. The conversion of cellulose to glucose involves three types of cellulases working in synergy: endoglucanases (EC 3.2.1.4) randomly cleave 13-1,4 glycosidic linkages of cellulose, cellobiohydrolases (EC 3.2.1.91) attack cellulose chain ends to produce cellobiose dimers which are converted into glucose by the 13-glucosidases (EC 3.2.1 21). Unexpectedly, the amount of l3-glucosidase (BGLI) from T. reesei hyperproducing strains represents a very low percentage of the total secreted proteins. A suboptimal content of this enzyme limits the performance of commercial cellulase preparations as cellobiose represents the main inhibitor of the cellulolysis reaction by cellobiohydrolases. This bottleneck can be alleviated either by overexpressing the f3-glucosidase in T. reesei or optimized its specific activity. After giving a brief overview of the main available technologies, this example will be used to illustrate the potential of directed evolution technologies to devolop enzymes tailored to fit industrial needs. We describe the L-ShuffiingTM strategy implemented with three parental genes originating from microbial biodiversity leading to identification of an efficient 13-glucosidase showing a 242 fold increase in specific activity for the pNPGIc substrate compared to WT (Wild Type) Cel3a beta-glucosidase of T. reesei. After expression of the best improved 13-glucosidase in T. reesei and secretion of a new enzymatic cocktail, improvement of the glucosidase activity allows a 4-fold decrease of cellulase loading for the saccharification of an industrial pretreated biomass compared to the parental cocktail. L’hydrolyse enzymatique de la lignocellulose est l’un des principaux goulets d’étranglement dans le développement de la conversion biologique de la biomasse lignocellulosique en biocarburants. L’un des organismes les plus efficaces pour la production d’enzymes cellulolytiques est le champignon Trichoderma reesei, principalement grâce à sa capacité importante de sécrétion. La conversion de la cellulose en glucose implique trois types de cellulases travaillant en synergie : les endoglucanases (EC 3.2.1.4) clivant de façon aléatoire les liaisons glycosidiques en (3-1,4, les cellobiohydrolases (EC 3.2.1.91) attaquant la chaîne de cellulose aux deux extrémités afin de produire le cellobiose, dimère qui sera converti en glucose par l’action des (3-glucosidases (EC 3.2.1.21). De façon inattendue, la quantité de 3-glucosidase (BGL1) sécrétée par les souches de T. reesei représente un très faible pourcentage de la quantité totale des protéines sécrétées qui en fait donc une activité limitante du cocktail. Cette faible activité limite d’autant plus les performances du cocktail que le cellobiose représente le principal inhibiteur de la réaction cellulolyse par les cellobiohydrolases. Ce goulot d’étranglement peut être atténué soit par une surexpression de la (3-glucosidase chez T. reesei, soit par une amélioration de son activité spécifique. Après un bref aperçu des principales technologies existantes, cet exemple sera utilisé dans cette revue pour illustrer le potentiel des technologies d’évolution dirigée pour développer des enzymes répondant aux besoins de l’industrie des biotechnologies. Nous décrivons comment la mise en oeuvre d’une stratégie d’évolution dirigée par le L-ShufflingTM avec trois gènes parentaux provenant de la biodiversité microbienne permet d’obtenir des activités (3-glucosidases très améliorées par rapport à la Cel3a (3-glucosidase de T. reesei (activité spécifique 242 fois plus élevée pour le substrat pNPGIc). Cette amélioration de l’activité glucosidasique, après expression du gène codant pour la 3-glucosidase améliorée chez T. reesei et sécrétion du nouveau cocktail, permet une diminution d’un facteur 4 de la quantité de cocktail nécessaire à la saccharification d’une biomasse industrielle prétraitée (paille de blé).