METODOLOGIAS DE ISOLAMENTO CELULAR E OS SEU IMPACTO NOS NEUTRÓFILOS DE BAIXA DENSIDADE

Abstract

Introdução: Os neutrófilos são as células da imunidade inata mais numerosas em circulação no sangue humano. São divididos em duas subpopulações: neutrófilos de alta densidade (HDNs) e neutrófilos de baixa densidade (LDNs) sendo obtidos através do isolamento por gradiente de densidade. Quach e Ferrante (2017) demonstraram que o isolamento por gradiente de densidade ativa os HDNs por ficarem por muito tempo expostos aos monócitos durante o isolamento. Objetivos: Avaliar se o método de isolamento por gradiente de densidade poderia ativar os LDNs, comparando essa metodologia com a técnica de separação magnética (IMS) como etapa posterior ao isolamento por gradiente de densidade, técnica essa que vem sendo considerada padrão ouro por conta da sua alta pureza, menor tempo de isolamento e de não precisar de etapas adicionais como lavagens e de lise. Materiais e métodos: Foi realizada a coleta sanguínea de 15 voluntários saudáveis. Os LDNs de cada voluntário foram isolados pelas duas técnicas, a por gradiente de densidade utilizando o Ficoll e do IMS por meio do kit EasySep™Direct Human Neutrophil Isolation (Stem Cell). Os neutrófilos isolados foram marcados com os seguintes anticorpos: Anti-CD45 (diferenciação dos LDNs de outros grupos celulares), CD66b e CD177 (marcadores de ativação) e avaliação desses marcadores foi feita por citometria de fluxo. Além disso, do isolado celular final de cada técnica foi realizado uma contagem absoluta da população de monócitos residuais. A análise estatística foi executada pelo programa Jamovi®. Resultados: Em relação ao rendimento celular observado, o isolamento por IMS isolou uma porcentagem maior de LDNs em comparação com o isolamento por gradiente de densidade (3,9% vs. 1,13%; p = 0,01). Ao analisarmos a expressão do CD66b e do CD177, não houve diferença significativa na intensidade de fluorescência mediana (MFI) de ambos marcadores entre as duas técnicas; CD66b (13126 vs.13227; p > 0,05); CD177 (10718 vs. 5997 p > 0,05). Estes resultados sugerem que a técnica por gradiente não ativa mais os LDNs quando comparados com isolamento por IMS. E o número residual de monócitos no isolado final da técnica por gradiente foi maior que o da IMS (0,26*109/L vs. 0,08*109/L; p = 0,02). Discussão: Nossos resultados vão de encontro com o encontrado por Hardisty et al. (2021) que a técnica por IMS leva a um maior rendimento de LDNs isolados, mas não altera o seu estado de ativação quando comparado com a técnica isolamento por gradiente de densidade, mesmo reduzindo de forma significativa o número de monócitos residuais em contato com esses neutrófilos. Indicando assim que os LDNs por serem considerados neutrófilos mais ativados que os HDNs, os isolamentos em si, não teriam a capacidade de alterar mais esse estado de ativação ou há outros mecanismos responsáveis e que não envolvam diretamente os monócitos. No entanto, a maior limitação do nosso trabalho foi o número amostral. Conclusão: Nosso trabalho é promissor ao mostrar que o isolamentos por gradiente de densidade não altera o estado de ativação dos LDNs, diferentemente dos HDNs, o que indica que os mecanismos de ativação podem ser diferentes para essas duas subpopulações.