INIBIÇÃO FARMACOLÓGICA DE EZRINA REDUZ O CRESCIMENTO E REGULA GENES RELACIONADOS APOPTOSE E CICLO CELULAR EM LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA

Abstract

Objetivos: A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é uma neoplasia hematológica caracterizada por uma parada no processo de diferenciação de precursores linfóides em um estágio inicial e que pode invadir medula óssea, sangue periférico e locais extramedulares. As opções terapêuticas disponíveis para a pacientes adultos ainda permanecem limitadas, e as taxas de sobrevida global em 5 anos é inferior a 45%. Um dos principais objetivos do tratamento é prevenir recidivas e diminuir a invasividade em outros órgãos. Recentemente, nosso grupo de pesquisa identificou o gene EZR, que codifica a proteína ezrina, como um marcador independente de prognóstico e alvo molecular para leucemia mieloide aguda. A ezrina é uma importante proteína associada ao citoesqueleto e que permite a transdução de sinal entre proteínas de membrana e filamentos de actina. O objetivo do presente estudo foi verificar o impacto da inibição farmacológica de ezrina sobre a viabilidade, crescimento clonal autônomo e expressão gênica em modelos celulares de LLA. Material e métodos: A linhagens celulares leucêmicas Jurkat (PTEN mutada) NALM6 (ETV6-EBF1) e REH (ETV6-RUNX1) foram tratadas com concentrações crescentes dos inibidores de ezrina, NSC305787 e NSC668394. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT, o crescimento de colônias autônomas por cultivo em metilcelulose na ausência de fatores de crescimento, análises de expressão gênica foram realizadas por PCR quantitativo para a avaliação da expressão de genes relacionados ciclo celular e à apoptose. As análises estatísticas foram realizadas pelo teste ANOVA e pós-teste de Bonferroni e um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Resultados: O tratamento com ambos os inibidores foi capaz de reduzir significativamente a viabilidade celular de células Jurkat, NALM6 e REH de forma dependente de concentração (p < 0,05). O composto NSC305787 apresentou maior potência e eficácia que o NSC668394, portanto o composto NSC305787 foi selecionado para continuidade dos estudos. Os valores de IC50 para o composto NSC305787 foram de 5.1 μM para Jurkat, 3.3 μM para NALM6 e 4.3 μM para REH no tempo de tratamento de 24 horas. O tratamento em longo prazo com NSC305787 reduziu o crescimento clonal autônomo de células Jurkat, NALM6 e REH de forma dependente de concentração (p < 0,05). Um painel de 12 genes relacionados ao ciclo celular e apoptose foi investigado por RT-PCR quantitativo. NSC305787 (1,6 μM por 24 horas), regulou negativamente CCNA2, e regula positivamente CDKN1A, BCL2L1 e BIM (p < 0,05) em células Jurkat; regulou negativamente CCNA2 e BCL2, e positivamente BCL2L1, BAX e BAD em células NALM6; regulou negativamente CCNA2 e CCNB1 e regula positivamente CDKN1A, CDKN1B, BCL2L1, MCL1 e BAX em células REH. Discussão: A regulação negativa de genes relacionados a progressão do ciclo celular (CCNA2 e CCNB1) e resposta antiapoptótica (BCL2) e regulação positiva de genes relacionados a parada de ciclo celular (CDKN1A, CDKN1B), genes pró apoptóticos (BAX) apóiam a hipótese de que NSC305787 esteja envolvido com mecanismos de indução de morte celular. Conclusão: Nossos resultados indicam que o inibidor de ezrina, NSC305787, apresenta efeitos antileucêmicos em LLA, incluindo redução da viabilidade e clonogenicidade. Apoio: CNPq, CAPES e FAPESP.