PCR en tiempo real: una metodología útil para la detección y cuantificación de granulovirus

Abstract

El uso de baculovirus como agentes de control biológico de insectos plaga, se ha convertido en una estrategia efectiva que se ha implementado gradualmente en diferentes sistemas productivos a nivel mundial. Para el desarrollo de un bioplaguicida a base de baculovirus, es necesario contar con una metodología para determinar el título viral en el producto en proceso y terminado. Para tal fin, en este trabajo se diseñó y optimizó una técnica de cuantificación viral (Betabaculovirus) mediante PCR cuantitativo (q-PCR). Se utilizó una sonda TaqMan diseñada sobre el gen de granulina, altamente conservado. Para la técnica de q-PCR se determinó la especificidad, sensibilidad y reproducibilidad, encontrando que puede detectar y cuantificar aislamientos del género Betabaculovirus provenientes de cinco especies diferentes de insectos (granulovirus de Tecia solanivora, Phthorimaea operculella, Erinnyis ello, Tuta absoluta y Spodoptera frugiperda) incluso de diferente origen geográfico, pero no detecta aislamientos del género Alphabaculovirus (nucleopoliedrovirus de Spodoptera ornithogalli, Diatraea saccharalis o S. frugiperda). El límite mínimo de detección de la técnica fue de 6,4 x 10-4 ng de ADN, lo que equivale a 1,25 x 105 copias del gen. Así mismo, la variación intra e inter ensayos fue mínima, demostrando la reproducibilidad de la misma. La aplicabilidad de la técnica fue evaluada para la detección de granulovirus en muestras de larva, suelo, y para determinar la concentración viral en un bioplaguicida formulado como concentrado emulsionable. En conclusión, la técnica de q-PCR desarrollada fue reproducible, sensible y específica, con aplicabilidad en estudios de persistencia viral en campo, control de infecciones en crías de insectos y control de calidad de bioplaguicidas a base de betabaculovirus.