STATHMIN 1 É ALTAMENTE EXPRESSA E CONTRIBUI PARA A CLONOGENICIDADE EM MODELOS CELULARES DE LEUCEMIA PROMIELOCÍTICA AGUDA

Abstract

Objetivos: Stathmin 1 (STMN1) é uma proteína desestabilizadora de microtúbulos altamente expressa em neoplasias hematológicas. A proteína de fusão PML-RARα regula positivamente a expressão e atividade de STMN1. Utilizando a coorte do IC-APL, nosso grupo de pesquisa evidenciou que STMN1 é altamente expressa em amostras de medula óssea de pacientes com leucemia promielocítica aguda (LPA). No presente estudo, a associação da expressão de STMN1 com dados genômicos de pacientes com LPA, assim como os efeitos da inibição de STMN1 ou de um agente farmacológico estabilizador de microtúbulos (paclitaxel), foram investigados em células de LPA. Materiais e métodos: Os dados de expressão de RNAm de STMN1 em doadores saudáveis e pacientes com LPA foram obtidos do AmaZonia! e do estudo GSE172057. Os dados de expressão de STMN1 nas diferentes populações de células hematopoiéticas foram obtidos do estudo GSE24759. As análises de genômica funcional foram realizadas por análise de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA) e Gene Ontology. Para os estudos funcionais, linhagens celulares de LPA sensíveis (NB4) e resistentes ao ATRA (NB4-R2) foram expostas ao ATRA e/ou paclitaxel. A diferenciação granulocítica foi avaliada por marcação com CD11b e morfologia. O ciclo celular foi sincronizado por bloqueio duplo de timidina. Para o silenciamento de STMN1, as células foram transduzidas com shRNA mediado por lentivírus. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT, clonogenicidade pelo ensaio de formação de colônias autônomas e apoptose por marcação com anexina V/PI e citometria de fluxo. Expressões de genes e proteínas foram avaliadas por qPCR e Western blot. Resultados: A expressão de STMN1 está aumentada em amostras de pacientes com LPA (p < 0,05). A expressão diferencial de STMN1 está associada a processos de ligação a macromoléculas, sinalização mediada por receptores celulares e transdução de sinal. A GSEA identificou 23 assinaturas associadas à expressão diferencial de STMN1, entre elas, alvos de E2F, alvos de MYC, ponto de verificação G2/M, reparo de DNA, glicólise e sinalização PI3K/AKT/mTOR. STMN1 é altamente expressa em progenitores hematopoiéticos iniciais e reduz durante a diferenciação celular, incluindo subpopulações granulomonocíticas. A fosforilação de STMN1 é predominante no pool de células enriquecidas com mitose. Em células NB4 e NB4-R2, o silenciamento de STMN1 diminui o crescimento clonal autônomo (p < 0,05), mas não afeta a apoptose e a diferenciação induzidas por ATRA. As células NB4 e NB4-R2 apresentam alta sensibilidade ao paclitaxel (IC50 de 3,6 nM e 1,8 nM, respectivamente). O crescimento clonal autônomo é significativamente reduzido pelo paclitaxel (p < 0,05), o qual aumenta os níveis de marcadores de estabilidade dos microtúbulos (acetil-α-tubulina) e de dano em DNA (y-H2AX e CDKN1A). Discussão: A alta expressão de STMN1 em pacientes com LPA foi confirmada em uma coorte independente. Os dados da análise genômica indicam que a expressão de STMN1 está associada a assinaturas gênicas relacionadas à proliferação e ao metabolismo em LPA. Nossos resultados destacam a contribuição de STMN1 para clonogenicidade de células leucêmicas. Conclusão: Em resumo, nosso estudo adiciona novos insights sobre as funções da STMN1 e dinâmica de microtúbulos em LPA. Financiamento: CNPq, CAPES e FAPESP.