Kasmera (Dec 2007)
Identificación de Histoplasma capsulatum en muestras clínicas mediante la técnica de PCR en dos rondas
Abstract
Abstract: Histoplasmosis is a systemic mycosis whose diagnosis is based on clinical, mycological and immunological criteria. Identification of its etiological agent in biological samples is difficult to perform. We evaluated a nested-PCR technique to identify Histoplasma capsulatum in clinical specimens (blood and bone marrow) and reference strains. Three different methods for DNA isolation were tested based on the reagents Guanidine thiocyanate, Benzoyl chloride and Triton X-100. Among these procedures, Guanidine thiocyanate-based method yielded by utmost good quality DNA and was easy to perform when used with clinical specimens. However, a better recovery of DNA was accomplished with the Triton-X-100 method. Reference strains of Paracoccidioides brasiliensis, Candida glabrata, Cryptococcus neoformans and Coccidioides immitis (C posadasii)were tested to assess PCR assay specificity. The samples were amplified by nested-PCR and analyzed by 3% agarose gel electrophoresis. Each of the reference strains showed the same signal upon amplification with a DNA band of 210 bases pairs, as well as 5 blood samples and 2 bone marrow specimens, with high sensitivity (10 picograms of Histoplasma capsulatum DNA) and specificity (no cross reactivity with P. brasiliensis, C. glabrata, C. neoformans and C. immitis). This technique has proved to be useful as a diagnostic technique. Resumen: La histoplasmosis es una micosis profunda de distribución mundial cuyo diagnóstico se fundamenta en estudios clínicos, micológicos e inmunológicos. La identificación del agente etiológico en muestras biológicas es difícil de realizar. Se evaluó la técnica de PCR en dos rondas para identificar ADN de Histoplasma capsulatum en muestras clínicas (sangre y médula ósea) y cultivos del hongo. Se ensayaron 3 métodos de aislamiento de ADN basados en los reactivos Tiocianato de Guanidina, Cloruro de Bencilo y Triton-X-100. La técnica de aislamiento con Tiocianato de guanidina resultó de fácil aplicación en muestras clínicas. Sin embargo, se obtuvo un mayor rendimiento de ADN con el reactivo Triton-X-100. La aplicación de la prueba de PCR generó un amplificado de 210 pares de bases el cual fue identificado tanto en las cepas de referencia de H. capsulatum como en 5 muestras de sangre y 2 muestras de médula ósea. Para confirmar la especificidad de la prueba se analizaron cepas de otros hongos no relacionados, Paracoccidioides brasiliensis, Candida glabrata, Cryptococcus neoformans y Coccidioides immitis (C posadasii) las cuales resultaron negativas. La técnica de PCR mostró una sensibilidad de hasta 10pg de ADN de H. capsulatum confirmándose así su utilidad como herramienta de diagnóstico molecular.
