Análise de interferon humano recombinante presente em formulações farmacêuticas | Recombinant human interferon analysis in pharmaceutical formulations

Abstract

Introdução: Em virtude do interesse para o tratamento da hepatite, o processo de produção industrial do INF-α foi desenvolvido e aperfeiçoado ao longo dos últimos anos. Objetivo: O presente trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo para caracterizar a estrutura molecular do INF-α2b em formulações farmacêuticas por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF. Método: Inicialmente foi desenvolvido um método de cromatografia líquida baseado em fase reversa para promover a separação entre o INF-α2b constituinte ativo e minoritário e a soro albumina humana, também componente presente nas formulações farmacêuticas, obtendo-se amostras com homogeneidade proteica, revelada por eletroforese. As amostras em solução foram submetidas à digestão com tripsina, levadas ao espectrômetro de massa MALDI-TOF. Para que fosse analisada a estrutura molecular, foi desenvolvido um procedimento baseado em imunoafinidade e cromatografia de gel filtração. Resultados: As amostras preparadas por estes métodos apresentaram homogeneidade proteica por eletroforese, sendo analisadas por dicroísmo circular e fluorescência, o que demonstrou ter degradação da estrutura tridimensional. Conclusões: Esse trabalho fornece dados importantes que subsidiam o estabelecimento de um protocolo para a análise de INF-α2b em produto final, que poderia substituir o mapa de peptídeos tradicional por cromatografia líquida, com a vantagem de resultar em um maior número de informações sobre a estrutura molecular do biofármaco. ========================================== Introduction: Due to the interest in the treatment of hepatitis, the industrial production process of INF-α has been developed and perfected over the last few years. Objective: The present work aimed to develop a protocol to characterize the molecular structure of INF-α2b in pharmaceutical formulations by MALDI-TOF mass spectrometry. Method: Initially, a reversed-phase liquid chromatography method was developed to promote the separation of active and minor constituent INF-α2b and human serum albumin, also present in the pharmaceutical formulations, to obtain samples with protein homogeneity revealed by electrophoresis. Samples were hydrolyzed with trypsin and submitted to MALDI-TOF. In order to analyze the molecular structure, a procedure based on immunoaffinity and gel filtration chromatography was developed. Results: Prepared samples by these methods showed protein homogeneity by SDS-PAGE, and were analyzed by circular dichroism and fluorescence, which showed three – dimensional structure degradation. Conclusions: This work provides important data that support the establishment of a protocol for the analysis of INF-α2b in final product, which could replace the traditional peptide mapping by liquid chromatography, with the advantage of resulting in a larger amount of information about the structure of the biopharmaceutical.

Keywords

• Interferon-alfa; Proteínas; MALDI-TOF; Dicroísmo Circular; Fluorescência
• Alpha Interferon; Protein; MALDI-TOF; Circular Dichroism; Fluorescence