Hematology, Transfusion and Cell Therapy (Oct 2023)

PIPKIIα NA REGULAÇÃO DOS GENES DA HEMOGLOBINA HUMANA EM CÉLULAS KU812: ESTUDOS PRELIMINARES DE KNOCKDOWN DO GENE PIP4K2A E INIBIÇÃO ENZIMÁTICA

  • D Malimpensa,
  • JO Gonçalves,
  • FF Costa,
  • SE Jorge

Journal volume & issue
Vol. 45
pp. S52 – S53

Abstract

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Introdução: A regulação dos genes HBE, HBG, HBD e HBB da hemoglobina (Hb) é realizada pela região de controle do locus β (β-LCR), onde se ligam fatores de transcrição, como EKLF, ou repressores gênicos - quais BCL11A. Estudos demonstram que esta relação também possa ser influenciada por vias quais PTEN/AKT/mTORC1 e MAPK, bem como pela atuação epigenética da proteína de metilação UHRF1, reguladas por fosfoinositídeos das vias que envolvem as fosfatidilinositol-fosfato quinases. Estudos realizados pelo Laboratório de Hemoglobinopatias (FCM-Unicamp) apontam que o gene PIP4K2A, da fosfatidilinositol-fosfato-quinase-II-alfa (PIPKIIα), está altamente expresso em precursores eritróides CD34+ e traz evidências de seu envolvimento na regulação da expressão dos genes HBA, HBB e HBG em modelos eritroleucêmicos K562 e KU812. Objetivos: Investigar os efeitos do silenciamento gênico de PIP4K2A bem como da inibição da atividade de PIPKIIα na expressão e síntese de globinas. Materiais e métodos: Realizou-se ensaios de knockdown de PIP4K2A por CRISPR-Cas9 utilizando 2.5ug de vetores plasmidiais contendo as sequências de RNAs guias (gRNAs) complementares a PIP4K2A: 5-TTTTAACAAGTAAGTACAAG-3, 5-GATCCGAACATCGACGTCTA-3(Genscript, EUA),transfectadas à linhagem KU812 (ATCC CRL-2099) por nucleofecção (4D Nucleofector X Unit - Lonza -Basiléia, CH). Análise proteica por Western Blotting foi realizada após 72h de nucleofecção (n = 1) e a quantificação proteica relativa (em porcentagem-%) medida pelo programa ImageJ (National Institutes of Health, EUA). A viabilidade celular foi avaliada por azul de trypan 0,4% (Thermo Fisher Scientific, USA) (n = 3). Para os ensaios de inibição enzimática, as células KU812 foram tratadas com 50uM (12h) do inibidor de PIPKIIα AG-82 (Santa Cruz Biotechnology, EUA) (n = 3). Análises de expressão gênica foram realizadas pelo método de comparação relativa (ddCT) à expressão dos genes ACTB e GAPDH a partir de ensaios de qRT-PCR (StepOnePlus - Applied Biosystem, EUA). Cálculos de significância estatística (p < 0,05) foram atribuídos pelos testes t (distribuição normal) ou Wilcoxon (sem distribuição normal) no programa SPSS (International Business Machines Corporation, EUA). Resultados e discussão: Experimentos de CRISPR-Cas9 resultaram na redução significativa da viabilidade celular de KU812 (p = 0.001; 72h/nucleofecção, n = 3), corroborando com dados de literatura acerca do papel desta enzima na viabilidade celular neoplásica (THP-1, astrócitos, na leucemia mieloide crônica e leucemia linfocítica aguda). Obteve-se redução parcial (20%) de PIPKIIα em relação ao controle (células submetidas à corrente elétrica da nucleofecção) e expressivo aumento das concentrações de globinas (1033%), β (128%) e γ (102%) - n = 1, dados estes que deverão ser replicados. A inibição de PIPKIIα nas condições supracitadas resultou no aumento significativo dos transcritos HBB (p = 0.009) e HBG (p = 0.006) em relação ao controle (tratado com DMSO) (n = 3). Não foram observadas alterações significativas na expressão de HBA. Conclusão: Resultados preliminares de knockdown de PIP4K2A por CRISPR e inibição de PIPKIIα com o composto AG-82 são bastante concordantes, sugerindo que o silenciamento/inativação de PIPKIIα tenha papel preponderante na viabilidade celular tanto quanto no aumento de expressão/síntese dos genes de globina, particularmente no locus β. Apoio financeiro: Fapesp, CAPES, CNPq, Funcamp e Faepex.