LC-ESI-MS/MS NA IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES ETIOLÓGICOS DA SEPSE

Abstract

Introdução/Objetivos: Sepse é a disfunção múltipla de órgãos causada pela resposta inflamatória irregular do corpo a uma infecção, incluída como prioridade em Saúde Pública pela Organização Mundial de Saúde. É a maior causa de mortes entre pacientes admitidos UTIs, o que é associado à falta de diagnóstico/tratamento eficiente em tempo adequado. O diagnóstico por hemocultura considerado padrão ouro na diagnose, demanda de 3 a 7 dias para o resultado final e baixa sensibilidade. Avanços têm sido realizados na identificação de patógenos a partir de hemocultura positiva, como automação dos testes fenotípicos e bioquímicos, testes moleculares e espectrometria de massas (MS) pela técnica MALDI-TOF, porém a dependência do cultivo prévio ocasiona importantes limitações, com aproximadamente 70% de resultados falso negativos e longo tempo necessário para o crescimento (1 a 5 dias ou mais). Neste estudo desenvolvemos uma prova de conceito para metodologia baseada em LC-MS/MS com o objetivo de monitorar íons de alta intensidade específicos para micro-organismos relacionados à sepse, diretamente de amostras de sangue total, sem a necessidade de cultivo microbiológico. Metodologia: O método que desenvolvemos tem como etapas metodológicas partindo de amostra de sangue total: lise diferencial de pH básico e lise celular ácida, extração/digestão rápida das proteínas do microrganismo e o uso da LC/ESI-MS/MS na análise/identificação dos peptídeos únicos discriminatórios de cada patógeno estudado. Resultados: Demonstramos a eficácia de nossa metodologia ao diagnosticar amostras infectadas com um ou mais dos seguintes patógenos: S. aureus, P. aeruginosa e C. albicans. Nosso método selecionou peptídeos discriminantes a partir dos dados gerados por LC-MS/MS que forneceram identificações corretas para todos os microrganismos mencionados acima com sensibilidade de 87,5% em sete horas e sem necessidade de enriquecimento em microcultura. Conclusão: Apresentamos um procedimento simples e rápido para a pré-seleção de um painel de peptídeos a ser usado para diagnóstico. A vantagem do nosso método é que podemos diagnosticar patógenos diretamente do sangue total, ao invés de passar pelo processo de cultura, configurando uma alternativa diagnóstica para sangue infecção. Prevemos também que nosso método será útil na identificação de fungos filamentosos e no diagnóstico de resistência antimicrobiana, em última análise, contribuindo para dados epidemiológicos.

Keywords

• Sepse Sangue total Diagnóstico molecular Peptídeos discriminatórios Espectrometria de massa