АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ ARABIDOPSIS THALIANA С ПОНИЖЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНА NDB2

Abstract

Обоснование. Альтернативный путь дыхания митохондрий растений не связан с синтезом АТФ и, следовательно, не контролируется непосредственно энергетическим статусом клетки. Альтернативный дыхательный путь включает в себя ротенон нечувствительные NAD(Р)Н дегидрогеназы II типа, расположенные как на внешней, так и на внутренней поверхности внутренней мембраны митохондрий, убихинон и альтернативную оксидазу (AOX). Предполагается, что альтернативные NAD(P)H дегидрогеназы имеют функции, сходные с функциями AOX, среди которых термогенез, предотвращение образования АФК, окисление избытка восстановителей для продолжения метаболических путей и др. Публикаций об успешном подавлении экспрессии NDB2 пока недостаточно. Например, показано, что растения арабидопсиса, лишенные и AOX1a и NDB2 были более чувствительны к комбинированной засухе и повышенному освещению, в то время как растения, гиперэкспрессирующие эти гены, демонстрировали повышенную устойчивость и способность к постстрессовому восстановлению. Цель. Целью данной работы являлось изучить, как подавление экспрессии NDB2 в гетеротрофных клетках суспензионной культуры арабидопсиса повлияет на экспрессию других генов альтернативного пути дыхания, разобщающих белков, а также генов белков теплового шока в не стрессовых условиях. Материалы и методы. Для выделения РНК отбирали по 5 мл клеток суспензионных культур. РНК выделяли с помощью реактивов из набора GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Литва), согласно инструкции производителя. Синтез первой цепи кДНК осуществляли с использованием набора реактивов Thermo Scientific (Литва), согласно рекомендациям фирмы производителя. ПЦР-РВ проводили на приборе CFX96™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США), используя набор реактивов qPCR mix-HS SYBR (Евроген, Россия), согласно инструкции производителя. Анализ данных ПЦР-РВ проводили с помощью программного обеспечения SFX Manager (Bio-Rad, Германия). Все эксперименты проводились в двух аналитических и трех биологических повторностях. В качестве референсного гена использовали ген, кодирующий глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу – GAPD. Результаты. Количество мРНК гена NDB2 в клетках суспензионной культуры линии AS5 было снижено в 8,2 раза по сравнению с контролем Col-0. Подавление экспрессии гена NDB2 в клетках суспензионной культуры арабидопсиса линии AS5 приводило к увеличению количества транскриптов не только гена NDB4, но и NDB1, а также NDA2 и NDC1; в то же время экспрессия генов NDB3 и NDA1 снижалась по сравнению с клетками Col-0. Мы не обнаружили изменения уровней экспрессии генов AOX1a, AOX1b и AOX1d в клетках линии AS5 по сравнению с контролем, однако количество транскриптов гена AOX1c несколько увеличивалось. При анализе уровней экспрессии генов, кодирующих разобщающие белки, было обнаружено увеличение экспрессии гена UCP1 в клетках линии AS5. В клетках суспензионной культуры линии AS5 повышались уровни экспрессии всех исследуемых нами генов БТШ, кроме HSP17.7. Заключение. Таким образом, полученные результаты предполагают, что подавление экспрессии гена NDB2 в гетеротрофных клетках арабидопсиса в отсутствие стресса изменяет редокс-статус клетки, что, в свою очередь, приводит к изменениям уровней накопления транскриптов других генов NAD(Р)Н дегидрогеназ и увеличению экспрессии генов БТШ, при этом экспрессия ключевых генов AOX не изменяется.

Keywords

• arabidopsis thaliana (экотип columbia)
• nad(р)н дегидрогеназы ii типа
• экспрессия генов