Вестник защиты растений (Nov 2024)
Идентификация возбудителя стеблевого меланоза пшеницы Pseudomonas cichorii методом ПЦР в режиме «реального времени»
Abstract
Фитопатогенная бактерия Pseudomonas cichorii поражает широкий перечень сельскохозяйственных культур, в том числе вызывает стеблевой меланоз пшеницы – культуры стратегического значения для России. Возбудитель стеблевого меланоза регулируется импортерами российской зерновой продукции. В связи с этим, важная задача – актуализация метода идентификации P. cichorii на основе полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ). В качестве мишени для ПЦР-РВ использован участок длиной 90 п.о. одного из известных генов патогенности hrcRST P. cichorii. Положительный результат ПЦР-анализа был получен для референтных штаммов P. cichorii и подтвержден секвенированием ДНК последовательности ампликона. Полученные нуклеотидные последовательности были сопоставлены с гомологичными фрагментами генома типового штамма DSM 50259. В результате сравнительного анализа ДНК были изменены последовательности прямого праймера и зонда. Для зонда была показана возможность применения доступной на территории РФ модификации в которой используется сочетание красителя FAM и гасителя флуоресценции BHQ.Оценку специфичности новой праймерной системы ПЦР-РВ PscF/PscHrc751R/PscP1 проводили с использованием 107 штаммов бактерий рода Pseudomonas, включая P. cichorii, P. fuscovaginae, P. syringae, P. trivialis, P. viridiflava, P. chlororaphis, P. lutea, P. orientalis. С ДНК 4-х штаммов (P. poae, P. graminis и 2 штамма P. fluorescens) показана неспецифичная реакция на 35–37 пороговом цикле, накопление не имело экспоненциальный вид. Аналитическая чувствительность теста позволяет обнаружить P. cichorii в концентрации 101 КОЕ/мл. Тест ПЦР-РВ PscF/PscHrc751R/PscP1 может быть использован в качестве отборочного при обнаружении P. сichorii в растительной продукции и для характеристики чистых бактериальных культур.
Keywords
