Gayana (Jun 2008)
GENOMIC INTEGRITY EVALUATION IN SPERM OF CHOROMYTILUS CHORUS (MOLINA, 1782) BY COMET ASSAY EVALUACION DE INTEGRIDAD GENOMICA EN ESPERMATOZOIDES DE CHOROMYTILUS CHORUS (MOLINA, 1782) MEDIANTE ENSAYO COMETA
Abstract
The comet assays or single cell gel electrophoresis is a simple, rapid, relatively inexpensive and very sensitive method that has been recently widely used to evaluate genomic integrity (or DNA damage) in aquatic animals exposed to diverse physical and chemical agents. However, the accuracy to evaluate comets assay has been the major obstacle in order to determine specific damage undergone cellular stress. The aim of this study was to evaluate DNA fragmentation in sperm cells based in fluorescence image analysis. The species used was the giant mussel Choromytilus chorus. The in vitro experiments were carried out through oxidative stress with five hydrogen peroxide concentrations (0, 50, 100, 500 and 1000 mM). To evaluate DNA damage two groups of parameters were used: (1) Morphological comet parameters as tail length, nuclear diameter (head) and tail moment, and (2) Quantification of DNA strand breaks grade by fluorescence image analysis. The sperm DNA damage was possitively correlated with the morphological parameters, as they were exposed to an increasing dose range of H2O2 and negatively correlated with nuclear diameter. Additionally, fluorescence analysis showed that fragment sizes and the fluorescence intensity could be identified and related the level of DNA damage independently the intercellular variation of DNA strand breaks. The large fragment sizes decrease with H2O2 doses, while medium and small fragments increase in treatments with highest peroxide concentration. This study supported future research to examine comet assay conjugated with molecular approaches, especially in reference to integrate FISH to evaluate if the DNA fragmentation includes specific genes.El ensayo cometa o gel de electroforesis de única célula es un procedimiento sencillo, rápido, relativamente barato y un método muy sensible para evaluar la integridad del genoma (ADN o daños) en los animales acuáticos expuestos a diversos agentes físicos y químicos. Sin embargo, la precisión para evaluar los ensayos cometas han sido el principal obstáculo para determinar el daño específico sufrido por estrés celular. El objetivo de este estudio fue evaluar la fragmentación del ADN en espermatozoides basado en análisis de imágenes fluorescente. La especie utilizada fue el choro zapato, Choromytilus chorus. Los experimentos in vitro se llevaron a cabo por estrés oxidativo con cinco concentraciones de peróxido de hidrógeno (0, 50, 100, 500 y 1000 mM). Para evaluar el daño del ADN se utilizaron dos grupos de parámetros: (1) parámetros morfológicos de los cometas como la longitud de la cola, el diámetro nuclear (cabeza) y el tail moment, y (2) Cuantificación de la fragmentación de ADN mediante análisis de imagen fluorescentes. El daño del ADN en el esperma se correlacionó positivamente con los parámetros morfológicos, a medida que fue expuesto a una mayor dosis de H2O2 y negativamente correlacionado con el diámetro nuclear. Además, el análisis de fluorescencia mostró que los tamaños de los fragmentos y la intensidad de la fluorescencia pueden ser relacionados con el nivel de daño en el ADN independiente de la variación intercelular. Los fragmentos grandes disminuyen con la dosis de H2O2, mientras que los medianos y pequeños aumentan a mayor concentración de peróxido. Este estudio apoya futuras investigaciones para examinar el ensayo cometa en conjunto con enfoques moleculares, especialmente en referencia a la integración de FISH para evaluar si la fragmentación del ADN incluye genes específicos.
