METFORMINA IN VITRO INDUZ APOPTOSE E INIBE A VIA JAK/STAT EM MODELOS DE NEOPLASIA COM MUTAÇÃO CSF3R T618I

Abstract

Objetivos: O objetivo deste estudo é avaliar os efeitos celulares e moleculares da metformina em leucemia neutrofílica crônica (LNC) com CSF3R T618I. Como demonstrado anteriormente, linhagem celular Ba/F3 foi transduzida para expressar CSF3R T618I e tratada in vitro com metformina. Foi observado redução da viabilidade celular e indução da apoptose de forma dose-dependente. Em células primárias de sangue periférico e medula óssea de paciente com LNC CSF3R T618I, a metformina reduziu a viabilidade, aumentou a apoptose celular e aboliu a formação de colônias de células progenitoras hematopoiéticas. Material e métodos: Linhagem celular Ba/F3 CSF3R T618I foi tratada in vitro com metformina (dose course: Ø[RPMI], 1 mM, 5 mM, 10 mM e 20 mM por 24 horas; time course: 0, 4, 8, 12, 24, 48 e 72 horas na dose de 5 mM) e submetidas a western blot. Para avaliação do efeito do tratamento in vivo com metformina na carga tumoral das células Ba/F3 CSF3R T618I em modelo murino alográfico, fêmeas NSG de 8 a 12 semanas de vida, receberam injeção subcutânea dorsal contendo 2 x 106 células Ba/F3 CSF3R T618I, ressuspendidas em 50 μl de PBS e 50μl de Matrigel. Os animais foram seguidos até o primeiro animal atingir 1 cm do tumor no maior eixo, randomizados segundo peso e tamanho do tumor, em grupo tratado com metformina 125 mg/kg (n = 10) ou veículo (PBS, n = 9) via intraperitoneal, 1 vez ao dia por 11 dias. Os tumores foram obtidos e mensurados quanto ao peso e volume (V = W2 ×L ×0.52, em que W e L são os diâmetros menor e maior, respectivamente). Resultados e discussão: Na dose de 1 mM o efeito do tratamento da linhagem Ba/F3 CSF3R T618I com metformina foi dependente da via AMPK, o que não ocorreu em doses maiores. Observamos uma redução na fosforilação de STAT3, STAT5, MAPK e ERK e Rictor e um aumento na fosforilação de AKT e 4E-BP1, de forma dose-dependente. A apoptose foi induzida nas células tratadas com metformina, observado pela clivagem das proteínas Caspase 3 e PARP1. Dano do DNA foi verificado pela fosforilação de H2AX. Observamos uma redução nos níveis de fosforilação das proteínas JAK2, STAT3, STAT5, AKT e Rictor de forma tempo-dependente. Ativação de ERK foi verificada após 4 horas tratamento com diminuição nas últimas 48 horas. Em modelo murino, a metformina diminuiu a carga tumoral de células Ba/F3 CSF3R T618I até o dia 9 de tratamento, mas isso não foi sustentado até o fim do tratamento. Também não observamos diferenças no peso do tumor entre os dois grupos. Resultados de Western Blot dos tumores demonstraram um aumento na ativação das proteínas STAT3, AKT, Rictor e ERK e inibição de Ciclina D1 no grupo tratado. Conclusões: Em modelos celulares de neoplasia com mutação CSF3R T618I, a metformina in vitro induziu a apoptose e inibiu a via JAK/STAT, entretanto, o efeito antineoplásico da metformina in vivo não foi confirmado. Suporte: FAPESP, CAPES e CNPq.