RECONSTITUIÇÃO DO SISTEMA IMUNOLÓGICO HUMANO EM MODELO MURINO IMUNOSSUPRIMIDO

Abstract

Objetivos: Padronizar o processo de humanização do sistema imune de camundongos imunodeficientes da linhagem NSG, utilizando células-tronco hematopoéticas CD34+. Materiais e métodos: Amostras de sangue de cordão umbilical (UCB) humano foram obtidas do biobanco do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti (CAISM/UNICAMP) e criopreservadas em nitrogênio líquido. Para a obtenção de células CD34+, as amostras de UCB foram descongeladas a 37 ºC em PBS 1X + 2% de FBS e purificadas magneticamente com o kit de seleção positiva de CD34+ da Miltenyi. As células foram incubadas com MicroBeads magnéticas e FCRblocking, conforme as instruções do fabricante, e inseridas no campo magnético gerado pelo aparato de purificação. Antes de implantar as células CD34+ nos animais, eles passaram por um processo de condicionamento que consiste na irradiação total do corpo em dose subletal. Para identificar a dose ideal de irradiação, 15 camundongos NSG foram divididos em 2 grupos que receberam 2,5 Gy (grupo 1; n = 5) e 2,0 Gy (grupo 2; n = 10). Em seguida, um novo estudo avaliou o processo de humanização em 08 camundongos NSG que receberam 23 mil células CD34+ (proveniente de 2 doadoras), por via intravenosa em 100 μL de PBS 1X. O acompanhamento do xenotransplante de células-tronco ocorreu pelo monitoramento de células hCD45+ no sangue periférico dos animais por citometria de fluxo e os dados foram analisados no software FlowJo. Animais com > 25% de células hCD45+ no sangue periférico foram considerados humanizados. Além disso, foi realizada análise histológica com coloração por HE para avaliar a presença de infiltrados de células hematopoéticas nos tecidos murinos. Dados de sobrevida e peso dos animais também foram registrados. Resultados: Após 23 dias da irradiação, 80% e 20% dos animais morreram, nos grupos 1 e 2, respectivamente. No teste de humanização, três animais (37,5%) apresentaram > 25% de células hCD45+ no sangue periférico, no intervalo de 10-16 semanas, com maior proporção de linfócitos B (LB - ̃45%) em relação aos linfócitos T (LT - ̃7,29%) no sangue periférico e 4 camundongos (50%) morreram nos primeiros 38 dias após o transplante das células-tronco. Análise histológica revelou infiltrado hematopoético no baço. Discussão: A irradiação de 2,0 Gy é a dose ideal para o condicionamento pré-humanização dos camundongos da linhagem NSG. Obteve-se sucesso no processo de humanização dos animais, que foi confirmada pela presença de > 25% de células hCD45+ no sangue periférico, mas ainda é necessário mais estudos para entender porque a relação de linfócitos B x linfócitos T encontrada (̃81% LB x ̃14% LT) está diferente do descrito na literatura (5-10% LB x 70-85% LT CD3+). Uma proposta é humanizar camundongos com idade inferior a 4 semanas, pois animais mais novos tendem a apresentar as populações linfocitárias condizentes com o esperado. O processo de purificação das células CD34+ será otimizado para que a pureza final seja > 90%. Essa padronização poderá implicar diretamente na mortalidade, que pode ter sido causada pelos linfócitos T ativados que foram injetados junto com as CD34+ purificadas (pureza < 90%). Conclusão: Os dados sugerem que houve o desenvolvimento hematopoético humano nos camundongos NSG, com predominância de linfócitos B. Assim, para padronizar a humanização é essencial otimizar a purificação das células-tronco e investigar a reconstituição das células imunológicas no modelo murino. CEUA: 0045/2024; CEP: CAAE #59137022.9.0000.5376.