成纤维细胞与间充质干细胞来源外泌体修复急性皮肤创面的比较

Abstract

目的本研究旨在比较成纤维细胞来源外泌体与间充质干细胞来源外泌体对小鼠急性皮肤创面的修复作用。方法体外分离培养原代人真皮成纤维细胞（hDF）并鉴定。用超速离心法提取人真皮成纤维细胞来源外泌体（hDF-EXO）、人骨髓间充质干细胞来源外泌体（hMSC-EXO）并鉴定；两种外泌体与hDF共培养24 h后，CCK8细胞增殖实验和划痕实验检测细胞增殖和迁移活性；采用8周龄雌性C57BL/6小鼠构建急性全层皮肤切除模型，在伤口上分别局部涂敷PBS（对照组）、hDF-EXO、hMSC-EXO进行治疗。术后第0、2、4、7天观察小鼠伤口并计算伤口面积。术后第1天取伤口组织检测对外泌体摄取情况，并利用qPCR检测伤口组织TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10炎症因子水平。术后第7天取伤口组织进行HE染色观察伤口组织结构变化，免疫荧光染色观察伤口组织PDGFR-α、α-SMA、Ki67表达情况。结果hDF表面分子及特异性标志物表达符合成纤维细胞特性。hDF-EXO和hMSC-EXO的形状、粒径、标志物均符合外泌体鉴定标准，且两者浓度差异无统计学意义（P>0.05）；体外试验数据显示，CCK8法检测显示hDF-EXO组和hMSC-EXO组的细胞活力均显著高于对照组（P<0.01），且hDF-EXO组的细胞活力明显高于hMSC-EXO组（P<0.01）。划痕实验显示， hDF-EXO组24 h划痕面积修复率显著高于对照组（P<0.01）和hMSC-EXO组（P<0.05）；体内试验数据显示，术后第1天，观察到两种外泌体均被移植周围组织摄入。qPCR检测hDF-EXO组和hMSC-EXO组伤口组织TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子水平均显著低于对照组（均P<0.01），且hMSC-EXO组炎症因子水平低于hDF-EXO组（均P<0.01）。术后第7天hDF-EXO组和hMSC-EXO组伤口面积均显著小于对照组（均P<0.01），且hDF-EXO组伤口面积小于hMSC-EXO组（P<0.05）。HE染色显示，与对照组相比，hMSC-EXO组小鼠伤口残留血痂，表皮不连续，仅有部分新生纤维组织。hDF-EXO组小鼠实现了更快的伤口再上皮化，表皮连续性好，新生纤维组织排列整齐。免疫荧光染色显示，hDF-EXO组和hMSC-EXO组相比对照组，成纤维细胞、肌成纤维细胞及增殖细胞数量显著增多，且hDF-EXO组明显多于hMSC-EXO组。结论两种外泌体均能有效促进创面愈合，hDF-EXO通过显著促进成纤维细胞增殖、迁移以及分化为肌成纤维细胞（FMT）加速伤口修复，且其修复作用优于hMSC-EXO。而hMSC-EXO相较于hDF-EXO在伤口早期可发挥更佳的炎症抑制作用。

Keywords

• 外泌体;伤口愈合;成纤维细胞;间充质干细胞