Revista Brasileira de Fruticultura (Jun 2011)
Eficiência de isolamento e de plaqueamento de protoplastos de laranja-doce Isolation and platting efficiency of sweet orange protoplasts
Abstract
O isolamento e plaqueamento de protoplastos são fatores fundamentais para o sucesso no cultivo in vitro deste tipo de explante visando a manipulações genéticas. A composição da solução enzimática no isolamento, a densidade de cultivo, bem como o próprio genótipo utilizado são variáveis importantes nestas etapas. Desta forma, o objetivo do trabalho foi avaliar a eficiência de isolamento de protoplastos em função de três soluções enzimáticas e a eficiência de plaqueamento em função de cinco densidades de protoplastos e diferentes composições de meio de cultura em cultivares de laranja-doce. As soluções enzimáticas avaliadas para o isolamento de protoplastos foram: 1. celulase Onozuka RS 1%, macerase R-10 1% e pectoliase 0,2%; 2. celulase Onozuka RS 1%, macerase R-10 1% ; 3. celulase Onozuka R-10 4%, macerase R-10 1%. O plaqueamento dos protoplastos foi realizado nas densidades de 2 x 10(4); 5 x 10(4); 10(5); 2x 10(5) e 3 x 10(5) protoplastos.mL-1, nos meios de cultura EME 0,7M, BH3 0,7M e BH3 + EME 0,7M em ausência de luz, a 25 ± 1 ºC. A solução enzimática 2 proporcionou maior rendimento no isolamento de protoplastos das cultivares 'Hamlin', 'Natal' e 'Pera', e a solução enzimática 1 foi a mais adequada para a laranja 'Westin'. Para a cultivar 'Lima-Verde', a solução enzimática 3 foi a mais eficiente. A eficiência final de plaqueamento, avaliada aos 90 dias de cultivo, foi superior nas densidades de 3 x 10(5) e 2 x 10(5) protoplastos.mL-1 para as cultivares 'Hamlin', 'Natal' e 'Lima-Verde', e nas densidades de 2 x 10(5) e 10(5) protoplastos.mL-1 para a laranja 'Westin'.Protoplast isolation and culture are important factors for adequate in vitro culture of this type of explant to further genetic manipulations. The composition of the enzymatic solution, protoplast platting density, and plant genotype are important variables in these steps. Therefore, this work aimed to evaluate the isolation efficiency of protoplasts related to three enzymatic solutions and platting efficiency of protoplasts based on five cell densities in different culture media compositions of sweet oranges cultivars. The enzymatic solutions tested were: 1. celulase Onozuka RS 1%, macerase R-10 1% and pectoliase 0,2%; 2. celulase Onozuka RS 1%, macerase R-10 1% ; 3. celulase Onozuka R-10 4% , macerase R-10 1%. Protoplasts were cultured at densities of 2 x 10(4); 5 x 10(4); 10(5); 2x 10(5) e 3 x 10(5) protoplasts.mL-1 in EME 0,7M, BH3 0,7M e BH3 + EME 0,7M, in darkness, at 25 ± 1 ºC. The enzymatic solution 2 provided higher yield for 'Hamlin', 'Natal' and 'Pêra' sweet orange cultivars, and enzymatic solution 1 resulted in better protoplast isolation for 'Westin' sweet orange. For 'Lima Verde' sweet orange, enzymatic solution 3 was the most efficient. Final platting efficiency, evaluated 90 days after culture, was higher at the densities of 3 x 10(5) e 2 x 10(5) protoplasts.mL-1 for 'Hamlin', 'Natal', and 'Lima Verde' sweet orange cultivars, and at the density of 2 x 10(5) e 10(5) protoplasts. mL-1 for 'Westin' sweet orange.
