Ionically Bound Peroxidase from Peach Fruit

Abstract

Soluble, ionically bound peroxidase (POD) and polyphenoloxidase (PPO) were extracted from the pulp of peach fruit during ripening at 20°C. Ionically bound form was purified 6.1-fold by DEAE-cellulose and Sephadex G-100 chromatography. The purified enzyme showed only one peak of activity on Sephadex G-100 and PAGE revealed that the enzyme was purified by the procedures adopted. The purified enzyme showed a molecular weight of 29000 Da, maximum activity at pH 5.0 and at 40ºC. The calculated apparent activation energy (Ea) for the reaction was10.04 kcal/mol. The enzyme was heat-labile in the temperature range of 60 to 75ºC with a fast inactivation at 75ºC. Measurement of residual activity showed a stabilizing effect of sucrose at various temperature/sugar concentrations (0, 10, 20 %, w/w), with an activation energy (Ea) for inactivation increasing with sucrose concentration from 0 to 20% (w/w). The Km and Vmax values were 9.35 and 15.38 mM for 0-dianisidine and H2O2, respectively. The bound enzyme was inhibited competitively by ferulic, caffeic and protocatechuic acids with different values of Ki,. L-cysteine, p-coumaric and indolacetic acid and Fe++ also inhibited the enzyme but at a lower grade. N-ethylmaleimide and p-CMB were not effective to inhibit the enzyme demonstrating the non-essentiality of SH groups.As peroxidases solúvel, ionicamente ligada e a polifenoloxidase de pêsssego foram acompanhadas durante o armazenamento a 20°C. A forma ionicamente ligada foi purificada 6,1 vezes utilizando-se de cromatografias de DEAE-celulose e Sephadex G-100. A enzima purificada foi eluída em um único pico de atividade na cromatografia de Sephadex G-100 e a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) revelou uma enzima purificada pelos procedimentos adotados. A enzima purificada apresentou um peso molecular de 29000 Da , pH e temperatura ótimos de pH 5,0 e 40°C. O valor da energia de ativação da reação foi de 10,04 kcal/mol. A enzima apresentou-se termolábil na faixa entre 60-75°C com rápida inativação a 75°C. Medida da atividade residual mostrou um efeito estabilizante da sacarose a várias temperaturas e concentrações do açucar (0, 10 e 20%, p/v) com uma energia de ativação (Ea) para inativação crescente com a concentração de sacarose. As constantes cinéticas Km e Vmax foram calculadas para o-dianisidina e peróxido de hidrogenio. A enzima ligada foi inibida competitivamente por ácido ferúlico, cafeico e protocatéquico com valores distintos de Ki. L-cisteína, ácidos p-cumárico e indolacéico e Fe++, inibiram a enzima porém em menor intensidade. N-etilmaleimida e p-CMB (p-cloromercuribenzoato) não foram eficientes na inibição enzimática.

Keywords

• Peach peroxidases
• ripening
• purification
• kinetics
• heat stability