Comparison of different protocols for the bovine viral diarrhea virus detection by RT-PCR in pools of whole blood and blood serum artificially contaminated/ <br> Comparação de diferentes protocolos para a detecção do vírus da diarréia viral bovina por RT-PCR em grupos de sangue total e de soro sangüíneo, artificialmente contaminados

Abstract

The RT-PCR technique was optimized and evaluated to detect the 5’ untranslated region of bovine viral diarrhea virus (BVDV) from clinical samples that consisted of blood serum and whole blood artificially contaminated with the NADL strain of BVDV. To optimization of technique, the following conditions were evaluated: i) two pairs of primers, 103 / 372 (WEINSTOCK et al., 2001) and 324 / 326 (VILCEK et al., 1994), ii) four methods of nucleic acid extraction (phenol/chloroform/isoamyl alcohol; silica/guanidine isothiocyanate; a combination of the two previous methods; and TRIzol™) and iii) different concentrations and compositions of reagents and time/temperature of the reactions. Between the alternatives tested that resulted in the amplification of the 290 bp product that was easily visualized in ethidium bromide stained 2% agarose gel was that presented the following conditions: i) primers 103 and 372; ii) initial volume and clinical sample: 50 mL of blood serum; iii) extraction of nucleic acid: silica/guanidine isothiocyanate method; iv) reverse transcription: 9 mL extracted nucleic acid, 1xPCR buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.4 and 50 mM KCl), 1.5 mM MgCl2; 60 units of reverse transcriptase enzyme M-MLV, RNA denaturation at 97°C / 4 min, and reverse transcription at 42°C / 30 min; v) PCR: primers 103 / 372 with anneling temperature at 59°C. The utilization of RT-PCR within these optimized conditions allowed the amplification of the BVDV NADL strain (103,56 TCID50) from pools of artificially contaminated blood serum until the dilution 1:160.A técnica da RT-PCR foi otimizada e avaliada para a detecção da região 5’ terminal não-traduzida do genoma do vírus da diarréia viral bovina (BVDV) em amostras clínicas de bovinos, constituídas por soro sangüíneo e sangue total, artificialmente contaminadas com a estirpe NADL do BVDV. Para a otimização da técnica foram avaliados: i) dois pares de primers, 103 / 372 (WEINSTOCK et al., 2001) e 324 / 326 (VILCEK et al., 1994) ii) quatro métodos de extração do ácido nucléico (fenol / clorofórmio / álcool isoamílico; sílica / isotiocianato de guanidina; uma combinação dos dois métodos anteriores e TRIzol™) e iii) diferentes concentrações e composições de reagentes, tampões e tempo/temperatura das reações. Entre todas as alternativas testadas a que resultou na amplificação de um produto com 290 pb, que foi facilmente visualizado em gel de agarose 2% com brometo de etídeo, foi a que empregou as seguintes condições: i) primers 103 e 372; ii) volume inicial e amostra clínica: 50 mL de soro sangüíneo; iii) extração do ácido nucléico: método da sílica / isotiocianato de guanidina, iv) transcrição reversa: 9 mL do ácido nucléico extraído, 1xPCR buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,4 e 50 mM KCl), 1,5 mM MgCl2, 60 unidades da enzima transcriptase reversa M-MLV, desnaturação do RNA a 97°C / 4 min e transcrição reversa a 42°C / 30 min e v) PCR: primers 103 / 372 com temperatura de anelamento de 59°C. A utilização da RT-PCR nas condições otimizadas nesse estudo possibilitou a amplificação da estirpe NADL do BVDV (103,56 TCID50) em pools, artificialmente contaminados, de soro sangüíneo de bovinos até a diluição de 1:160.

Keywords

• Bovino
• Diarréia viral bovina
• BVDV
• RT-PCR
• Soro sangüíneo.