Mutis (Dec 2013)
Estandarización de la técnica de PCR para amplificar el genoma mitocondrial de las tortugas cabezona (Caretta caretta) y carey (Eretmochelys imbricata) anidantes del Caribe colombiano
Abstract
Las tortugas marinas, Eretmochelys imbricata y Caretta caretta se encuentran distribuidas en aguas tropicales del Indo-Pacífico y Atlántico y son consideradas especies importantes dentro del ecosistema. Estas tortugas se han catalogado en peligro crítico ya que han sido explotadas por su caparazón, huevos y carne. Las poblaciones de ambas especies se encuentran en un declive poblacional significativo en el Caribe colombiano. Los estudios genéticos del ADN mitocondrial permiten el apoyo de planes de manejo y conservación. En el presente estudio se estandarizaron las mejores condiciones de la técnica de PCR para la amplificación de 22 fragmentos de 800 pb solapadas en 50 pb del mitogenoma de las tortugas E. imbricata y C. caretta. Se diseñaron oligonucleótidos-primers para la amplificación de estos mitogenomas a partir de secuencias previamente descritas de la tortuga verde Chelonia mydas. Se evaluó la concentración de Mg+2, ADN, oligonucleótidos-primers y la temperatura de anillamiento. La reacción estandarizada de PCR se obtuvo en un volumen final de 25 μl, conteniendo 20-70 ng de DNA, 0,5-1 mM de cada oligonucleótidos-primers, 1,5-3,0 mM de Mg+2, 1 U de Taq polimerasa y 0,2 mM de cada dNTP’s. Los parámetros de amplificación optimizados fueron: desnaturalización inicial de 5 min a 94 °C, seguida por 35 ciclos de 94 °C por 1 min, 37-50 °C por 1 min (de acuerdo a los oligonucleótidos-primers) y 72 °C por 1 min. Se obtuvo el 63 % de la secuencia de la tortuga carey y el 68 % de la tortuga cabezona. Estas secuencias presentaron un 99-100 % de identidad con las secuencias previamente reportadas.
