Классические и активирующие химерные антигенные рецепторы PD-1 как элемент мультитаргетного подхода в лечении гематологических и солидных новообразований

Abstract

Цель. Создание анти-PD-L1 CAR T-эффекторов, несущих внеклеточный домен PD-1 в качестве антигенраспознающего участка, и исследование их цитолитической активности. Функциональная оценка анти-PD-L1 CAR T-эффекторов in vitro с перспективой применения в мультитаргетной терапии опухолевых новообразований. Материалы и методы. Конструкция химерного антигенного рецептора PD-1 была создана с помощью молекулярного клонирования антигенраспознающего участка молекулы человеческого PD-1 (аминокислоты 12–170) в экспрессионный плазмидный вектор млекопитающих с добавлением активационного и костимулирующего доменов. Первичные Т-лимфоциты мононуклеарной фракции периферической крови здорового донора получены методом экспансии комбинации моноклональных антител по поверхностным маркерам CD3/CD28. Анти-PD-L1 CAR T-эффекторы получены путем лентивирусной трансдукции генома первичных Т-лимфоцитов здорового донора. Экспрессию химерного рецептора PD-1 и эффективность трансдукции оценивали методом проточной цитофлюориметрии. Специфическую цитотоксическую активность анти-PD-L1 CAR T-эффекторов анализировали in vitro с помощью теста цитотоксичности в реальном времени (RTCA) при сокультивировании с клетками-мишенями линии HeLa_PD-L1. Содержание цитокинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ, IL-17A оценивали методом проточной цитофлюориметрии с использованием набора Human Th1/Th2/Th17 CBA Kit (BD, США). Результаты. Эффективность лентивирусной трансдукции и доля анти-PD-L1 CAR T-эффекторов составили 42 %. Специфичность цитотоксического ответа анти-PD-L1 CAR T-эффекторов при низком соотношении эффектора/опухоли (1:20) верифицирована снижением клеточного индекса (КИ) при сокультивировании с HeLa_PD-L1 (КИ = 0,738) в 1,5 раза по сравнению с контролем (КИ = 1,0645). Увеличение синтеза цитокинов IL-2 (1000 пг/мл), IL-6 (438,5 пг/мл), TNF-α (44 пг/мл), IFN-γ (1034 пг/мл) при сокультивировании с таргетной линией-мишенью HeLa_PD-L1 указывает на функциональность исследуемых клеток-эффекторов. Заключение. Нами получен и проверен in vitro химерный антигенный рецептор против PD-L1. Анти-PD-L1 CAR T-лимфоциты специфически «узнают» и способствуют цитолизу опухолевых клеток-мишеней путем высокой секреции провоспалительных цитокинов IFN-γ, TNF-α, IL-6 и IL-2. Химерный антигенный рецептор PD-1 можно модифицировать в активирующий (CSR) делецией CD3ζ-домена и использовать совместно с другими CAR без прогнозируемой неспецифической токсичности.

Keywords

• CAR T-клеточная терапия
• PD-1
• анти-PD-L1 CAR T-эффекторы
• микроокружение опухоли
• мультитаргетная иммунотерапия