OTIMIZAÇÃO DA TÉCNICA DE SEQUENCIAMENTO DE SANGER DE REGIÕES DO GENE UL97 PARA IDENTIFICAÇÃO DE MUTAÇÕES DE RESISTÊNCIA DO CITOMEGALOVÍRUS ASSOCIADAS AO TRATAMENTO COM GANCICLOVIR

Abstract

Introdução/Objetivo: A DNAemia do citomegalovírus humano (HCMV) continua a ser um desafio em pacientes transplantados. Particularmente preocupante é o surgimento de cepas com mutações, frequentemente localizadas no gene UL97, que ocasionam resistência a antivirais de primeira linha, como ganciclovir (GCV). Estudos com foco na resistência do HCMV são limitados, tornando os dados sobre a prevalência escassos. Nesse sentido, nosso objetivo é a otimização do sequenciamento de Sanger para identificação de mutações no gene UL97 do HCMV que conferem resistência ao tratamento com GCV. Métodos: A detecção da carga viral de HCMV no plasma foi realizada por RT-qPCR pelo ensaio Alinity m CMV. Amostras positivas com carga viral de HCMV acima de 3000 cópias/mL foram submetidas à extração de DNA viral seguida por Nested-PCR. A amplificação do produto obtido foi confirmada por eletroforese em gel de agarose. O produto foi purificado usando a enzima ExoSAP-IT PCR Product Cleanup e sequenciado. As sequências obtidas foram alinhadas com a sequência de referência NC_006273.2 (cepa Merlin) através do software Unipro UGENE, v.47.0, e analisadas quanto à presença ou ausência de mutações que causam resistência ao GCV. Resultados: O estudo está em andamento; até o momento, 10 das 25 amostras coletadas de pacientes transplantados foram sequenciadas. Dessas, nove amostras eram de pacientes transplantados de órgãos sólidos (renal, hepático e cardíaco) e uma de paciente transplantado de medula óssea. Na análise dos sequenciamentos, foram identificadas mutações em duas amostras distintas: a mutação P509L (originada pela troca nucleotídica C143323T) e a D605E (originada pela troca nucleotídica C143612G). Conclusão: Embora a alteração identificada como P509L apresente fenótipo desconhecido e a mutação D605E trata-se de um polimorfismo viral que não possui evidências na literatura de causar resistência ao tratamento de GCV, através da utilização da técnica de sequenciamento de Sanger foi possível analisar as sequências nucleotídicas do fragmento que contém as principais alterações relacionadas com resistência antiviral. Assim, é possível obter informações importantes para a compreensão dos padrões mutacionais das cepas de HCMV associadas ao GCV e servir como potencial ferramenta de acompanhamento para pacientes transplantados.

Keywords

• Citomegalovírus sanger UL97 resistência