PCR with Paracoccidioides brasiliensis specific primers: potential use in ecological studies PCR com «primers» específicos de Paracoccidioides brasiliensis: uso potencial em estudos ecológicos

Abstract

The precise microenvironment of Paracoccidioides brasiliensis has not yet been discovered perhaps because the methods used are not sensitive enough. We applied to this purpose the polymerase chain reaction (PCR) using three sets of specific primers corresponding to two P. brasiliensis genes. This fungus as well as several other fungi, were grown and their DNA obtained by mechanical disruption and a phenol chloroform isoamylalcohol-based purification method. The DNA served for a PCR reaction that employed specific primers from two P. brasiliensis genes that codify for antigenic proteins, namely, the 27 kDa and the 43 kDa. The lowest detection range for the 27 kDa gene was 3 pg. The amplification for both genes was positive only with DNA from P. brasiliensis; additionally, the mRNA for the 27 kDa gene was present only in P. brasiliensis, as indicated by the Northern analysis. The standardization of PCR technology permitted the amplification of P. brasiliensis DNA in artificially contaminated soils and in tissues of armadillos naturally infected with the fungus. These results indicate that PCR technology could play an important role in the search for P. brasiliensis’ habitat and could also be used in other ecological studies.O microambiente adequado do Paracoccidioides brasiliensis não foi ainda bem esclarecido, talvez porque os métodos utilizados não sejam suficientemente sensíveis. Aplicamos com este propósito, a reação em cadeia da polimerase (PCR) usando três jogos de primers específicos do P. brasiliensis, correspondendo a dois dos genes do P. brasiliensis. Este fungo, assim como outros fungos, foram cultivados e seus DNAs obtidos por ruptura mecânica e purificados com mistura de fenol-clorofórmio com álcool isoamílico. Os DNAs serviram para a reação de PCR utilizando-se primers específicos para dois dos genes do P. brasiliensis que codificam para as proteínas antigênicas, denominadas, 27 kDa e 43 kDa. O limite mínimo de detecção para o gene 27 kDa foi de 3 pg. A amplificação para os dois genes foi positiva só com o DNA do P. brasiliensis; além disso, o mRNA para o gene de 27kDa estava presente apenas no material do P. brasiliensis, como mostrado pela análise por Northern-blot. A padronização da técnica do PCR permitiu a amplificação do DNA do P. brasiliensis em solos contaminados artificialmente com o fungo e em tecidos de tatus infectados na natureza. Estes resultados indicam que a técnica do PCR podería ter um papel muito importante na pesquisa do habitat do P. brasiliensis e, além disso, podería ser utilizada em outros estudos ecológicos.

Keywords

• P. brasiliensis
• PCR detection
• Specific primers
• Soil and animal detection