Revista Cubana de Investigaciones Biomédicas (Dec 2012)
Estandarización de un ensayo inmunoenzimático para la detección de anticuerpos anti-ADN doble cadena en el lupus eritematoso sistémico Standardization of an immunoenzymatic assay to detect anti-double-stranded DNA antibodies in systemic lupus erythematosus
Abstract
Introducción: los anticuerpos anti-ADN doble cadena son un marcador serológico diagnóstico de lupus eritematoso sistémico (LES). El ensayo inmunoenzimático en fase sólida es una técnica rápida y rentable para su detección. Objetivo: estandarizar un ELISA que detecte anti ADN doble cadena para el diagnóstico del lupus. Métodos: los pasos que se siguieron para la estandarización incluyeron la preparación de controles, la sensibilización de la fase sólida, la selección de los amortiguadores y conjugado del ensayo, la evaluación de las condiciones de reacción y la determinación del nivel de corte. Además se realizó el estudio de inespecificidades. Se probaron 5 tipos de placas de poliestireno y se compararon ADN plasmídico de E.coli, pUC19 y ADN genómico humano como antígenos de recubrimiento. Se evaluó el efecto de la poli-L-lisina y la irradiación de la placa con luz ultravioleta, en la fijación del antígeno. El valor de corte del ensayo se determinó por el método del valor límite. Resultados: se observó disociación del antígeno cuando no se utilizó poli-L-lisina en el pretratamiento de la placa y la irradiación con luz UV no favoreció la unión del ADN a la fase sólida. No se encontraron diferencias significativas (p=0,710) entre ambos ADN, en el recubrimiento. El valor de corte (K=3) permitió clasificar como positivas 28 muestras (63,6 %) de pacientes con LES. Conclusiones: el método estandarizado, con el empleo de ADN plasmídico, permitió la detección de anticuerpos anti-ADN doble cadena en pacientes con lupus.Introduction: anti-double-stranded DNA antibodies are a diagnostic serological marker for systemic lupus erythematosus (SLE). The solid-phase immunoenzymatic assay is a rapid, cost-effective technique for their detection. Objective: Standardize an ELISA detecting anti-double-stranded DNA for the diagnosis of lupus. Methods: the standardization process included the following steps: preparation of controls, sensitization of the solid phase, selection of buffers and assay conjugate, evaluation of reaction conditions and determination of the cut-off level. A study of unspecificities was also conducted. Five types of polystyrene plates were tested, and a comparison was made of E. coli (pUC19) plasmid DNA and human genomic DNA as coating antigens. An evaluation was conducted of the effect of poly (L-lysine) and irradiation of the plate with ultraviolet light upon antigen fixation. The assay cut-off value was determined by the limit value method. Results: antigen dissociation was observed when poly (L-lysine) was not used in the pretreatment of the plate and UV light irradiation did not foster DNA binding to the solid phase. No significant differences were found (p=0.710) between the two DNA coatings. The cut-off value (K=3) made it possible to classify 28 samples of patients with SLE as positive (63.6 %). Conclusions: the method standardized with the use of plasmid DNA enabled detection of anti-double-stranded DNA antibodies in patients with lupus.
