Pengaruh H2O pH 5,2 dan TE Buffer pH 7,8, Untuk Perbaikan Efisiensi Reaksi qPCR Skoring HER-2 Kanker Payudara

Abstract

Abstrak. Validitas reaksi qPCR untuk aplikasi teknologi diagnostik ataupun deteksi sangat penting. Reaksi qPCR yang valid, akan memberikan hasil dengan tingkat kepercayaan yang tinggi. Untuk mengukur validitas reaksi dapat dilakukan dengan mengukur nilai Koefisien korelasi (R2), Efisiensi (E), dan Coefficient of variability (CV) yang terbentuk. Her-2 merupakan protein proto-onkogen sebagi biomarker prognosis dan factor prediktif pengobatan terhadap trastuzumab. Penentuan skoring status HER-2 dapat dilakukan menggunakan teknik Immunohistochemistry (IHC), Fluorosence In Situ Hibriditation (FISH) dan qPCR. Dari ketiga teknik diatas, pendekatan menggunakan qPCR merupakan pendekatan yang dapat dikuantifikasi. Untuk mengkuantifikasi status skoring HER-2 dibutuhkan pengukuran amplifikasi HER-2 dan gen kalibrator. Gen WHN merupakan salah satu gen yang dapat digunakan sebagai kalibrator skoring HER-2. Efisiensi qPCR dilaporkan dipengaruhi oleh banyak faktor, diantaranya adalah pH. pH diketahui berpengaruh terhadap kerja dari polymerase dan integritas DNA. Pada penelitian ini akan dibandingkan dua pelarut berbeda, H2O pH 5,2 dan Buffer TE pH 7,8 terhadap efisiensi reaksi qPCR skoring HER-2. Preparasi pGEM-T easy whn juga akan dilaporkan pada penelitian ini menggunakan teknik yang standar, yang kemudian akan digunakan sebagai bahan DNA template untuk pengenceran secara serial dengan dua kali factor pengenceran untuk mengukur nilai R2, E, dan CV yang menjadi parameter validitas reaksi qPCR. Dari hasil penelitian ini nilai Ct pGEM-T whn yang dilarutkan dengan H2O pH 5,2 memiliki nilai Ct lebih rendah dibandingkan dengan TE buffer pH 7,8, yang secara signifikan mempengaruhi efisiensi qPCR. Nilai R2 dan E reaksi qPCR untuk H2O pH 5,2 dan TE buffer pH 7,8 adalah: 0,98 dan 115%; 0,99 dan 99% untuk masing-masingnya . Selanjutnya nilai CV yang terbentuk berada dibawah 10% pada kedua pelarut tersebut. Hasil konfirmasi dengan elektroforesis gel dan analisis melt peak untuk kedua standar menunjukkan satu pita tunggal dengan ukuran yang ditargetkan (93 bp) dan peak tunggal dengan Tm ±81 oC. Berdasarkan hasil penelitian ini, TE buffer pH 7,8 merupakan pelarut ideal untuk mendapatkan efisiensi uji qPCR yang ideal untuk aplikasi penentuan skoring status HER-2 pada pasien kanker payudara berdasarkan metode qPCR. Kata kunci: kurva standar, qPCR, RNase- free water, TE buffer, koefisien korelasi (R2), efisiensi